Nucleostemin基因沉默对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RNA干扰沉默Nucleostemin(NS)基因后对食管癌Eca-109细胞株增殖和凋亡的影响。方法用NS基因特异性siRNA表达载体转染食管癌Eca-109细胞株,通过绘制细胞生长曲线和克隆形成实验检测细胞增殖能力;CCK-8法测试细胞增殖抑制率;RT-PCR法检测NS基因表达量的变化,TUNEL法和DNA Ladder检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,S组细胞的增殖速率降低,24、48及72h细胞增殖抑制率分别为60.32%、72.29%和86.00%;NS基因表达量下降;细胞凋亡指数增加(18.28%),可见梯状DNA降解带。结论 NS基因沉默导致食管癌Eca-109细胞株增殖抑制,凋亡增加。     

Skp2-siRNA对Eca-109食管癌细胞系p27kip1蛋白表达的影响

目的 观察通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)使Skp2基因沉默转染后对食管癌Eca-109细胞株中p27kip1表达的影响.方法 以Eca-109食管癌细胞系作为实验对象,设计合成针对Skp2的siRNA并进行转染.实验分为转染组、空白对照组、转染对照组、阴性对照组.采用免疫组化方法(SP法)检测各组Eca-109食管癌细胞系p27kip1蛋白表达的情况,采用Imageproplus(IPP)测定累积光密度值(IOD).每张切片选5个视野,求IOD 均值.采用方差分析进行组间均数比较,以p<0.05表示差异有统计学意义.结果 ①RNAi-Mate转染Eca-109细胞6 h后用荧光显微镜检测,计数转染Eca-109细胞的效率＞80%,本实验选此比例作为实验浓度.②经过转染后24 h的细胞开始变圆,生长比同时间正常培养的对照组细胞缓慢,48 h后细胞出现凋亡,有部分细胞脱落,72 h后细胞脱落变多.③免疫组化检测结果显示:转染 24 h后p27kip1蛋白表达开始上升IOD值为7.295±0.277、48 h后上升最明显IOD值为9.075±0.880、72 h 后p27kip1蛋白表达开始下降IOD值为3.506±0.160,与空白对照组相比较,差异有显著统计学意义(P<0.01,psiRNA=0.000),转染组24 h、48 h、72 h之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 将人Skp2-siRNA转染入Eca-109食管癌细胞系后,能有效通过下调Skp2的表达,而上调p27kip1蛋白的表达.说明Skp2在Eca-109食管癌细胞增殖调控中起到重要作用,RNAi技术有可能作为抑制肿瘤细胞生长的一种手段.     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

RNA干扰抑制cyclin E表达对食道癌细胞Eca-109增殖的影响

目的 探讨利用RNAi技术抑制cyclin E的表达,研究cyclin E在食道癌细胞Eca-109生长、增殖过程中的作用.方法 设计针对cyclin E基因的siRNA序列,合成并克隆入pGFU6/neo质粒中,用脂质体转染法将重组质粒转染Eca-109细胞.采用RT-PCR和免疫印迹试验检测稳定转染的Eca-109细胞中cyclin E的表达水平.台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺人试验、平板克隆形成试验检测干扰cyclin E后对细胞活力以及增殖能力的影响,流式细胞仪测定细胞周期时相分布.Westem印迹检测细胞增殖有关蛋白PCNA、p21、bax和bcl-2表达变化.结果 台盼蓝排斥法、MTT法、3H-TdR掺入试验和平板克隆形成试验显示转染组细胞活力及增殖受到抑制;阻滞在G0/G1期细胞比例增加.Western印迹表明PCNA和bcl-2蛋白表达量下降;而p21蛋白和Bax蛋白表达量上升.结论 沉默cyclin E基因能明显抑制食道癌细胞Eca-109的活力及增殖能力,并且细胞周期被阻滞,机制可能与下调肿瘤细胞内PCNA以及上调p21的表达有关.     

RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将Bcl-xL小干扰RNA（siRNA）转染食管癌EC109细胞,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测食管癌细胞Bcl-xL mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型检测癌细胞增殖和侵袭力。结果与对照组相比,siRNA转染组细胞Bcl-xL mRNA和蛋白水平明显下调（P均〈0.05）,所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少（P均〈0.05）,并均呈浓度依赖性。结论采用RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达,可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力。     

干细胞Nanog蛋白在食管癌组织中的表达及意义

目的 探讨食管癌组织中干细胞Nanog蛋白表达,分析其与食管癌临床病理特征的关系.方法 收集87例食管癌患者的癌组织及癌旁正常组织标本,采用免疫组化法检测癌组织及癌旁正常组织中的Nanog蛋白表达,同时用免疫荧光技术检测食管癌细胞系TE-1、Eca-109中的Nanog蛋白表达.结果 Nanog蛋白在食管癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织(P＜0.05),Nanog蛋白在食管癌组织中的表达与其病理分期、分化程度和淋巴结转移有关(P均＜0.05).食管癌细胞系TE-1、Eca-109中的Nanog阳性蛋白呈高表达,且表达存在异质性;多数细胞以细胞质表达为主,少数以细胞核表达为主,细胞核表达阳性率为10％.结论 Nanog蛋白在食管癌组织中的表达与食管癌的发生、发展及转移密切相关.     

RNA干扰PKM2对食管癌细胞株Eca109生物学特性的影响

目的将靶向PKM2的siRNA转染食管癌细胞株Eca109,观察转染后细胞内PKM2基因的表达变化及其对Eca109细胞增殖和周期的影响。方法将人工合成的针对PKM2基因的siRNA片段通过Lipofectamine 2000转染食管癌细胞株Eca109;实验分为实验组、空白对照组和阴性对照组,分别用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantita-tive PCR,qRT-PCR)和Western blot法检测各组细胞中PKM2的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果与空白对照、阴性对照比较,实验组细胞中PKM2 mRNA及蛋白表达减少(P<0.05),Eca109细胞转染PKM2 siRNA后,增殖能力减弱,细胞周期被阻滞在G0/G1期。结论 PKM2对Eca109细胞的生长起促进作用。     

玉竹提取物B对人食管癌细胞Eca-109增殖与凋亡的影响

目的观察玉竹提取物B（EB-PAOA）对人食管癌细胞Eca-109增殖与凋亡的影响。方法将体外培养的Eca-109细胞与不同浓度的EB-PAOA共育,采用MTT法检测Eca-109细胞增殖抑制率,采用流式细胞仪检测Eca-109细胞凋亡率。结果随着EB-PAOA浓度增大、作用时间延长,Eca-109细胞的增殖抑制率逐渐升高（P均〈0.05）,呈时间、剂量依赖性;随着EB-PAOA浓度增加,Eca-109细胞凋亡率逐渐增加,呈一定浓度依赖性（P均〈0.05）。结论EB-PAOA能够抑制人食管癌细胞Eca-109的增殖,并诱导其凋亡。     

苦参素注射液对人食管癌Eca-109细胞周期的影响及机制研究

目的 探讨苦参素对人食管癌Eca-109细胞增殖周期的影响及其机制.方法 运用流式细胞术检测细胞周期变化和调控细胞增殖周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的表达.结果 与阴性对照组和阳性对照组比较,苦参素对Eca-109细胞持续作用48 h后,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少(P均<0.05);CyclinD1和CDK4的表达量均随苦参素剂量增加而减少.结论 苦参素可以明显将人食管癌Eca-109细胞阻滞于G0/G1期,其主要机制可能与CyclinD1及CDK4的低表达有关.     

沉默PDCD4基因对食管癌细胞生物学特性的影响

目的探讨沉默PDCD4基因对食管癌细胞生物学特性的影响。方法选取27例食管癌患者的癌组织和对应的癌旁组织,采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测PDCD4表达水平,对患者5年生存率进行调查分析,并分析PDCD4表达与食管癌临床病理学特征的相关性。采用Western blot法检测食管癌细胞的PDCD4蛋白表达。利用siRNA特异沉默PDCD4基因表达。将si-PDCD4或si-NC转染到食管癌细胞TE-1中,转染稳定后,在0、24、48和72 h利用MTT法检测细胞增殖能力。用结晶紫染色法检测转染细胞克隆形成能力,用细胞划痕实验(Wounding heal)检测转染细胞迁移能力。结果 PDCD4在癌组织及癌细胞中显著低表达,PDCD4相对高表达的患者生存率高于低表达PDCD4的患者。沉默PDCD4基因能够增强食管癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力。结论沉默PDCD4基因促进了食管癌细胞的增殖与迁移。     

PIM1对老年食管癌患者癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨PIM1对老年食管癌患者癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将RNAi重组质粒(PIM1-shRNA-3)经脂质体介导转染食管癌ECA-109细胞株。PIM1基因沉默(PPIM1-shRNA-3)稳定转染的ECA-109细胞(转染组),用空质粒载体稳定转染的ECA-109细胞(空白转染组)和正常培养的ECA-109细胞(对照组)作为对照进行体外研究。通过细胞计数法绘制细胞生长曲线图,RT-PCR法测量PIM1基因表达水平,CCK-8法计算其增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI流式法和TUNEL法测算凋亡情况来检测细胞的增殖能力。结果载体成功转入到食管癌细胞中并表达,转染组ECA-109细胞数量减少;转染组肿瘤细胞PIM1基因表达水平明显低于空白转染组和对照组(P<0.05),且转染组PIM1 mRNA相对表达与空白转染组和对照组相比显著降低(P<0.05);相比空白转染组和对照组,ECA-109细胞计数和增殖能力在转染组明显降低(P<0.05);与空白转染组和对照组比较,转染组细胞的细胞抑制率明显升高,P<0.05;TUNEL和Annexin V-FITC/PI法检测结果表明:PIM1基因沉默可促进细胞的凋亡反应,进而抑制细胞的增殖水平。结论食管癌ECA-109细胞株可通过PIM1基因沉默抑制增殖,增加凋亡。     

RNA干扰Akt对食管癌细胞株Eca109生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Akt对人食管鳞癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态(VM)形成的影响.方法:应用倒置荧光显微镜观察Akt的干扰质粒转染食管癌细胞Eca109后绿色荧光蛋白的表达;采用Western blot方法检测Akt蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖能力的变化;Transwell方法...     

RNAi抑制人大肠癌LOVO细胞Bmi-1基因的表达

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因表达对人大肠癌细胞株LOVO增殖和侵袭力的影响及机制。方法将化学法合成的针对Bmi-1mRNA不同位点设计的3对siRNA序列（siR-NA1～3）和1对带有荧光标记的FAM-siRNA（siRNA4）转染至人大肠癌LOVO细胞,荧光显微镜下观察siRNA的转染效率,QRT-PCR检测Bmi-1mRNA表达抑制作用,Western Blot检测Bmi-1蛋白表达变化,MTT法检测LOVO细胞体外增殖变化,小室侵袭实验检测LOVO细胞侵袭能力。结果利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达70%。siRNA1对mRNA表达抑制率最高,从而筛选出沉默效应最强的siRNA序列为siRNA1。siRNA1转染组LOVO细胞Bmi-1蛋白表达,增殖及侵袭力明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。结论化学合成的靶向Bmi-1siRNA转染人大肠癌LOVO细胞能有效抑制Bmi-1的mRNA和蛋白质表达水平,Bmi-1基因的RNA干扰可有效抑制人大肠癌LOVO细胞的增殖和侵袭能力。     

JNK MAPK信号通路在食管癌细胞系Eca-109细胞中的作用机制

目的探讨c-jun氨基末端激酶1/2（c-jun N-teuninal kinase,JNK 1/2）信号通路在食管癌细胞系Eca-109细胞中的作用。方法体外培养Eca-109细胞,以特异性JNK信号转导通路抑制剂SP600125处理Eca-109细胞;RT-PCR的方法检测JNK1和JNK2基因的表达,Western blot法检测JNK和p-JNK蛋白的表达,MTT（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-di-phenyltetrazolium bromide）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Eca-109细胞经SP600125分别处理24h和48 h后,分别与对照组比较,JNK1 mRNA的表达无统计学差异（均P〉0.05）,JNK2 mRNA的表达也无统计学差异（均P〉0.05）,但活化的JNK即P-JNK1/2蛋白的表达显著减少,细胞的增殖显著被抑制,细胞的凋亡率有统计学差异（均P〈0.05）。结论 JNK信号通路可能在Eca-109细胞的发生发展中发挥重要作用。     

白藜芦醇对人食管癌细胞Eca-109增殖的影响及其机制探讨

目的观察白藜芦醇（Res）对人食管癌细胞Eca-109增殖的影响,并探讨其机制。方法将Eca-109细胞分别与0、10、20、40μmol/L的Res共同培养,采用MTT法测定Res对Eca-109细胞的生长抑制率,采用RT-PCR法检测Eca-109中的VEGF mRNA。结果随着Res浓度增加、作用时间延长,Eca-109细胞生长抑制率增加（P均〈0.05）,VEGF mRNA表达量降低（P均〈0.05）。结论Res可抑制Eca-109细胞增殖,其作用可能与抑制VEGF表达有关。     

siRNA靶向干扰ROBO1基因表达对食管癌细胞周期、增殖及相关蛋白的影响

目的研究siRNA靶向干扰轴突导向受体蛋白(ROBO)1基因表达对食管癌EC109细胞增殖、细胞周期的影响及可能作用机制。方法实验将食管癌EC109细胞随机分为空白组、对照组、siRNA-ROBO1组,采用脂质体将阴性siRNA和siRNAROBO1转染EC109细胞;Western印迹检测ROBO1、细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白的表达;CCK-8实验检测细胞的增殖活力;流式细胞仪检测EC109细胞周期的变化。结果干扰ROBO1表达后,EC109细胞中ROBO1蛋白的表达量较空白组显著降低(P0.05),细胞增殖活性显著降低(P0.05),G0/G1期细胞显著增加(P0.05),G2/M期细胞显著降低(P0.05),且siRNA-ROBO1组细胞中Ki-67、PCNA、Cyclin D1表达量较空白组明显降低(P0.05)。结论ROBO1可能通过影响食管癌细胞增殖、周期相关蛋白水平使细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制食管癌细胞增殖。     

siRNA干扰PDCD4表达对人食管鳞状细胞癌细胞株Eca109的影响

背景:研究发现PDCD4是一种新的肿瘤抑制基因,其表达与多种肿瘤的恶性转化相关。然而,PDCD4在食管鳞状细胞癌中的作用尚未完全明确。目的:探讨沉默PDCD4表达对食管鳞状细胞癌细胞株Eca109体外增殖、迁移、凋亡能力的影响。方法:选择未转染的Eca109细胞(空白对照组)、转染无义序列的Eca109细胞(阴性对照组)和转染PDCD4 siRNA的Eca109细胞(si-PDCD4组),采用蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,平板单克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果:与空白对照组、阴性对照组相比,si-PDCD4组细胞中PDCD4蛋白表达降低(P0.05),细胞增殖能力增强(P0.05),细胞克隆形成数目增多(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05),细胞迁移能力增强(P0.05)。结论:PDCD4 siRNA可在体外促进食管鳞状细胞癌Eca109细胞的增殖、迁移,并抑制细胞凋亡,为食管鳞状细胞癌的诊治提供了新的实验依据。     

ALA-PDT对人食管癌Eca-109细胞相关凋亡蛋白表达的影响

目的 探讨5-氨基乙酰丙酸—光动力疗法(ALA-PDT)对人食管癌Eca-109细胞相关凋亡蛋白表达的影响.方法 将人食管癌Eca-109细胞经过培养、处理后分为两组,ALA-PDT组(PDT组)细胞用ALA孵育6h后在光动力治疗系统下进行光照,光照后24h提取细胞总蛋白和胞质蛋白;对照组细胞不进行光动力治疗.采用Western blot法检测两组细胞中的Bcl-2、Cytc蛋白表达.结果 ALA-PDT作用于人食管癌Eca-109细胞后,与对照组比较,PDT组胞质中的Bcl-2蛋白表达量明显降低,Cytc蛋白表达量明显升高(P均＜0.05).结论 线粒体凋亡通路可能是ALA-PDT诱导Eca-109细胞凋亡的主要通路,Bcl-2可能为该凋亡通路的靶基因之一,释放Cytc进而诱导细胞凋亡可能为ALA-PDT诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡的线粒体通路终末效应之一.     

小干扰RNA抑制胃癌细胞环氧合酶-2的表达

目的 观察瞬时转染环氧合酶-2特异性小干扰RNA(COX-2 siRNA)对胃癌细胞增殖与凋亡的影响,探讨COX-2在胃癌发生中的作用和RNA干扰方法 对肿瘤的治疗作用.方法 以胃癌细胞系SGC7901为研究对象,瞬时转染COX-2 siRNA,转染后72 h用RT-PCR方法 分别检测COX-2siRNA组、无意义siRNA组及空白对照组的COX-2 mRNA表达;免疫组化法与Western blot检测3组细胞的COX-2蛋白质的表达;流式细胞仪检测3组的细胞周期和凋亡情况.转染后1周内每天同一时间用噻唑蓝比色分析法(MTr)检测3组癌细胞的活力并计算癌细胞的相对生存率.结果 COX-2siRNA对胃癌细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达均有明显抑制作用,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增加,但细胞周期分布无明显变化.结论 在胃癌细胞中,COX-2表达的抑制可降低胃癌细胞的增殖速度,促进肿瘤细胞凋亡,COX-2在胃癌的发生中可能具有重要作用.     

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.