丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增X基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期带者体内有HBV准种共存，X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响，将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，构建重组表达质粒，并分别与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，提取细胞裂解液，检测SV40启动子调控下的β－半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示：野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。提示X区不同核苷酸缺失突变和点突变均在不同程度上降低了其反式激活作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调S100钙结合蛋白A11基因启动子表达活性研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBV-X蛋白)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以解放军第302医院基因治疗研究中心自行构建的HBV-X蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)技术的筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-p),聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-S100-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 pCAT3-S100-p在HepG2细胞中能够指导CAT的表达;共转染实验中pCAT3-S100-p pcDNA3．1(-)-X组CAT的表达活性是pCAT3-S100-p的2．1倍。结论 所克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性作用;HBV的X蛋白具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了解放军第302医院基因治疗研究中心利用SSH技术及基因表达谱技术研究HBV-X蛋白反式激活作用的结果。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

乙型肝炎病毒DNA多聚酶RNase H对细胞凋亡易感基因表达的上调作用

目的探讨乙型肝炎病毒DNA多聚酶(HBV DNA P)结构域蛋白RNase H对细胞凋亡易感基因(CAS)的转录激活作用。方法以HBV DNA P结构域蛋白RNase H的反式调节因子的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定CAS的启动子区域(CASp),扩增CASp并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-CASp报告载体。分别以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-RH共转染肝癌细胞系HepG2细胞,ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以pCAT3-Basic空载体、pCAT3-TXNRD1p分别转染HepG2细胞作为阴性和阳性对照。结果pCAT3-CASp和pcDNA3.1(-)-RH瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-CASp的1.5倍,是pCAT3-Basic空载体的2.7倍。结论本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究RNase H蛋白反式激活作用的结果。我室克隆的CAS启动子具有顺式激活下游基因的活性;HBV的RNase H蛋白具有对CAS的反式激活作用。     

HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响

目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1基因表达的上调作用研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRDl)启动子转录的激活作用。方法 以302院传染病研究所基因治疗研究中心自行构建的乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式调节的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),PCR扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-preS2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-TXNRDlp和pcDNA3．1（-）-preS2瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的5．7倍、pCAT3-TXNRDlp的2．2倍。结论 该TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前-S2蛋白具有反式激活TXNRD1的作用。     

DDX41蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨含DEAD框解旋酶41 (DDX41)基因对乙型肝炎病毒(HBV)复制能力的影响及其作用机制.方法 通过慢病毒包装将稳定过表达DDX41或特异敲低DDX41的短发卡RNA (shRNA)重组质粒转染至HepG2.2.15细胞系,筛选和建立稳定过表达或敲低DDX41的细胞株;通过CRISPR-Cas9技术构建敲除DDX41的HepG2.2.15细胞株;蛋白免疫印迹法检测DDX41蛋白表达水平以及通路验证;酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达水平;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HBV复制相关DNA、RNA以及干扰素mRNA表达水平;Noahern印迹法检测HBV总RNA.结果 过表达DDX41可显著抑制HepG2.2.15细胞系中HBV的复制;而敲低或敲除DDX41可显著促进HepG2.2.15细胞系中HBV的复制.过表达DDX41可显著促进干扰素调节因子3(IRF3)的磷酸化和干扰素β(IFN-β)的表达;而敲低或敲除DDX41可显著抑制IRF3的磷酸化和IFN-β的表达.结论 在肝癌细胞系HepG2.2.15中,DDX41蛋白通过促进IRF3的磷酸化并诱导干扰素β的表达,进而发挥抑制HBV复制的功能.     

乙型肝炎病毒C基因G87变异对宿主细胞HLA-I表达的影响

目的 探讨HBV C基因G87变异对宿主细胞表面HLA-I表达的影响。方法 采用定点突变技术和亚克隆技术，将HBV野生型基因组质粒构建为C基因G87变异株表达载体(EBO-G87)和野生株表达载体(EBO-WT)，以脂质体技术分别转染HepG2细胞，转染细胞经FITC标记的鼠抗HLA-ABC mAb染色，流式细胞术测定细胞表面HLA-I的表达。结果 构建的EBO-G87和EBO-WT重组载体经内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定证实。HepG2细胞表面HLA-I表达的平均荧光强度，EBO空载体转染的细胞为2．3，EBO-WT转染的细胞明显增强至18．8，EBO-G87转染的细胞增至10.5。结论 2株HBV上调HLA-I表达强度不同，C基因G87变异可使宿主细胞表面的HLA-I表达水平发生改变。     

乙型肝炎病毒C基因G87变异对宿主细胞HLA-Ⅰ表达的影响

目的探讨HBV C基因G87变异对宿主细胞表面HLA-I表达的影响. 方法采用定点突变技术和亚克隆技术,将HBV野生型基因组质粒构建为C基因G87变异株表达载体(EBO-G87)和野生株表达载体(EBO-WT),以脂质体技术分别转染HepG2细胞,转染细胞经 FITC标记的鼠抗HLA-ABC mAb染色,流式细胞术测定细胞表面HLA-I的表达.结果构建的EBO-G87和EBO-WT重组载体经内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定证实.HepG2细胞表面HLA-I表达的平均荧光强度,EBO空载体转染的细胞为2.3,EBO-WT转染的细胞明显增强至18.8,EBO-G87转染的细胞增至10.5. 结论 2株HBV上调HLA-I表达强度不同,C基因G87变异可使宿主细胞表面的HLA-I表达水平发生改变.     

手背深度烧伤早期治疗不当的原因分析

手为暴露部位 ,烧伤机会多 ,约占 4 4 % 〔1〕。临床上以手背烧伤最多见 ,深度烧伤后如果早期治疗不当常造成严重畸形和功能障碍。我科自 1996年以来共收治手背深度烧伤 98例 ,其中 11例因早期治疗不当造成不良后果。现报告如下 :1　临床资料1 1　一般资料　本组 11例 ,男 7例 ,女 4例 ;年龄2 0岁～ 4 8岁。火焰烧伤 7例 ,热液烫伤 4例 ;手背烧伤为深Ⅱ度～Ⅲ度。入院后手部创面均采用暴露疗法 ,涂ＳＤ—ＡＧ液 ,手的姿势任患者自由摆置。 5例手背深Ⅱ度～Ⅲ度烧伤患者于伤后 3周行创面切削痂游离点状植皮术 ;6例手背深Ⅱ度烧伤患者任其自然…     

毛细支气管炎免疫机理及干扰素疗效研究

本文测定50例毛细支气管炎患儿T淋巴细胞亚群,同时观察干扰素(INF)治疗前后的变化并判定临床疗效,结果表明急性期呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿CD_8细胞明显升高,CD_4/CD_8比值明显降低(P<0.01),CD_3、CD_4细胞与正常对照组比较无明显差异(P>0.05);INF治疗后CD_8细胞显著降低,CD_4/CD_8比值明显升高(P<0.01);且临床疗效及病程均明显优于未用INF组。作者对本病发病机理及INF作用机制进行了讨论。     

大规模猪肝细胞低温保存方法的建立

目的　建立大规模猪肝细胞的低温保存方法以满足生物型人工肝治疗的需要。方法　用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞 ;加入本实验室配制的含有 10 %二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)的营养液中 ;分别采用两种降温方法使 (12 )× 10 10 猪肝细胞保存在 - 196℃液氮中 ;1个月后复温 ,观察在同一条件下培养不同时间后猪肝细胞形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果　用两种降温方法保存的肝细胞 ,复温后细胞的存活率均较高 (梯度降温组和程控降温组存活率分别较冻存前降低了 4 7%和 8 6 %) ,其中前者肝细胞的尿素、葡萄糖合成功能较后者高。结论　所建立的冻存方法简单易行 ,可保存大量的猪肝细胞。     

八种动物甲状腺组织几何学参数的定量分析(一)

用图象分析仪测定了8种动物甲状腺随机切片的显微照片(经涂墨加工),获得了该组织胶体的二维平面的图象数据。根据体视学原理计算了与胶体有关的几何学参数值,包括体积密度、表面积密度、平均自由程、数密度、平均体积、平均表面积、平均半径以及三维空间截线平均长度。结合对滤泡上皮细胞高、宽的测量结果,进一步计算了与滤泡有关的上述参数值。分析表明,甲状腺对碘的代谢功能与表征胶体结构的5项参数值显著相关。综合胶体的8项参数,各类动物可构成各自的种系星座图;分类判别有很高的正确判别率。     

胰腺囊性肿瘤15例分析

作者报告了该院３０年来经手术及病理证实的１５例胰腺囊性肿瘤，男５例，女１０例，其中囊腺瘤３例，囊腺瘤恶变３例，囊朱癌９例，肿瘤位于胰尾部８例，体尾部６例，胰头部１例。２例有肝转移，１例肿瘤浸润胃后壁，根治生切除１０例，单纯肿瘤切除、肿瘤切除加肝转移瘤局部切除、囊腺癌内外引流、肿瘤活检各１例。术后死亡１例。随访１２例，１０例效果满意，２例囊腺癌行内外引流者术后６、９个月死亡。文中讨论了胰腺囊性肿瘤的     

益欣康泰胶囊对老龄小鼠体内睾酮水平的影响

目的：研究益欣康泰胶囊对老龄小鼠体内睾酮的影响。方法：选用昆明种雄性小鼠５０只,随机分为五组,即对照组,阳性药物组及益欣康泰胶囊高,中,低剂量组,分别灌服蒸馏水,红参水煎液及益欣康泰胶囊高,中低,剂量的水溶液,于第１０天时统一在颈动脉取血做Ｔ测定;结果：红参组及益欣康泰胶囊三组与对照组比较,灌服益欣康泰胶囊后Ｔ含量明显升高,益欣康泰胶囊高剂量组与红参组比较Ｔ明显升高;     

结肠息肉癌变相关因素分析

目的　更好地认识癌变息肉的临床特点 ,找出与癌变息肉相关的因素 ,为临床初步判断息肉的性质提供依据。方法　回顾整理连续 4年内资料完整可用的结肠息肉病例 ,分析性别、年龄、息肉部位、数目、是否有蒂、黏膜情况、是否分叶、病理类型、息肉大小、不典型增生程度等因素。结果　单因素分析显示癌变与未癌变息肉在大小、黏膜情况、不典型增生程度、病理类型、是否分叶状等因素方面的差别具有统计学意义。逐步Logistic分析显示与癌变息肉独立相关的因素包括息肉大小、不典型增生程度、黏膜情况、是否有蒂及病理类型。结论　息肉越大、病理为腺瘤、不典型增生程度越重、黏膜有糜烂甚至溃疡、亚蒂或无蒂是与癌变息肉独立相关的因素 ,以上因素符合的越多则该息肉为恶性的可能性越大     

Ⅲ级胎盘亚分级的显微结构观察及体视学分析

目的:探讨Ⅲ级胎盘超声亚分级显微结构改变。方法:利用光镜观察各亚级胎盘的组织显微结构形念变化,并用体视学方法进行组织计量学分析。运用电子显微镜观察各亚级胎盘的组织超微结构形态变化。结果:两组胎盘显微结构形态学上有明显变化,组织计量学分析发现血管合体膜数、合体结节数、纤维素样坏死、绒毛间隙距离、绒毛血管直径等指标两组胎盘有非常显著差异,P<0.01。结论:ⅢA亚级胎盘和ⅢB亚级胎盘在组织学改变方面有明显差异,Ⅲ级胎盘超声亚分级有足够的组织学依据支持。     

Semmes-Weinstein单丝检测糖尿病足部神经感觉的应用研究

应用５．０７／１０ｇ Ｓｅｍｍｅｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ（单丝）随机检测１３２例糖尿病患者右足５个部位的感觉,结合足部震颤阈值分析研究每个单丝的敏感性和特异性。同时应用弯曲力分别为５ｇ和１５ｇ的单丝随机对２００例糖尿病患者右足５个部位进行检测。     

慢性肝炎213例临床病理分类探讨

应用传统分类及法Ｓｃｈｅｕｅｒ分类法观察２１３例慢性肝炎的肝穿病理切片，共２６０例次，结果显示Ｓｃｈｅｕｅｒ分类法与传统分类基本一致。但对反映病