nm23-H1基因对肺癌细胞株恶性表型的逆转作用

目的：通过稳定、高效的基因转染方法将nm23-H1基因导入nm23-H1基因缺失的人肺大细胞癌细胞株L9981,探讨nm23-H1基因是否具有逆转肺癌恶性表型的功能。方法：利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将nm23-H1基因导入L9981细胞株;利用细胞生长曲线、克隆形成率、Boyden小室法等方法研究转染前后细胞体外增殖、黏附、侵袭、转移能力的改变。结果：转染后的L9981细胞株中有nm23-H1基因mRNA和蛋白的阳性表达;转染后细胞株体外增殖速度减慢,克隆形成率降低,黏附性以及侵袭性均降低。结论：nm23-H1基因对肺癌细胞株L9981的体外生长、侵袭、转移具有负调控作用,表明nm23-H1基因具有逆转肺大细胞癌恶性转移表型的能力,为应用nm23-H1基因治疗肺癌提供了客观依据。     

nm23-H1基因转染对人高转移大细胞肺癌细胞株生物学行为的影响及作用机理

背景与目的nm23-H1基因已被证明是一个肿瘤转移抑制基因,但其相关作用机理仍不明确。本研究通过比较nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981生物学行为的变化,探讨nm23-H1基因影响人高转移大细胞肺癌细胞株生物学行为的可能机理。方法应用细胞体外增殖活性检测(MTT法)和体外侵袭力检测(改良Boyden小室法)技术分别检测nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌细胞株体外增殖活性和侵袭力的变化;同时加入PKC特异抑制剂Calphostin C作用后,再次观察三株细胞株抑制剂作用前后细胞侵袭力、增殖力的变化。结果nm23-H1基因缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981和L9981-pLXSN体外侵袭力和增殖活性明显高于转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1肺癌细胞株(P<0.001);L9981和L9981-pLXSN细胞间体外侵袭力和增殖活性则无统计学差异(P>0.05)。用PKC抑制剂Calphostin C处理L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌细胞株后,细胞体外侵袭力和增殖活性下降(P<0.001),而转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1细胞体外侵袭力和增殖活性仍低于L9981和L9981-pLXSN(P<0.001),L9981和L9981-pLXSN细胞间则无统计学差异(P>0.05)。结论nm23-H1基因可明显抑制L9981肺癌细胞株的细胞增殖力和侵袭力。nm23-H1基因对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的生物学行为的影响可能与其抑制PKC信号传导有关。     

nm23-H1基因稳定转染肺癌细胞的鉴定

目的：通过稳定、高效、低毒的基因转染方法将nm23-H1基因导入该基因缺失的人肺大细胞癌株L9981,从基因及蛋白水平鉴定nm23-H1基因转染肺癌细胞的建立。方法：以JM109为宿主菌,转化质粒载体PCMV-neo-Bam-nm23-H1,制备nm23-H1基因的真核表达载体;利用阳离子脂质体Lipofectamine介导,将nm23-H1基因导入L9981细胞株。采用RT-PCR技术检测转染后nm23-H1基因的表达,并用Western blot技术检测转染后nm23-H1蛋白的表达。结果：转染后的L9981细胞株中可检测到nm23-H1 mRNA及nm23-H1蛋白的阳性表达。结论：建立表达nm23-H1基因的肺癌细胞株L9981,为研究nm23-H1对肺癌恶性转移表型的逆转作用作基础准备。     

nm23-H1转染对肺癌细胞整合素分子表达的调控

目的通过基因转染方法将nm23-H1基因转入nm23-H1基因缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981,探讨nm23-H1基因对肺癌细胞整合素(integrin)分子表达的调控作用.方法应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将nm23-H1基因导入人高转移大细胞肺癌细胞株L9981;应用半定量RT-PCR技术检测nm23-H1基因转染前后integrin β1、integrin β3基因的mRNA表达;利用流式细胞仪技术检测nm23-H1基因转染前后integrin β1、integrin β3基因的蛋白表达.结果 (1)转染后获得稳定、高效表达nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1,该细胞株的integrin β1、integrin β3 mRNA表达水平显著低于原代细胞株L9981.(2)转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1中integrin β1、integrin β3蛋白表达水平显著低于原代细胞株L9981(P＜0.01).结论 nm23-H1基因转染能显著下调人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中integrin β1和integrin β3 mRNA和蛋白表达,表明nm23-H1基因可通过调控细胞integrin表达逆转人高转移大细胞肺癌L9981细胞株的转移潜能.     

nm23-H1基因转染逆转人高转移大细胞肺癌恶性表型分子机制的实验研究

背景与目的nm23-H1是公认的肿瘤转移抑制基因。我们的前期研究结果发现nm23-H1基因可明显抑制人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1／2的活性。本研究旨在探讨肿瘤转移抑制基因nm23-H1及外源性ERK1／2通路抑制剂U0126对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中ERK1／2及其细胞恶性生物学行为的影响，为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法将稳定转染nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1、原代细胞株L9981（nm23-H1基因杂合性缺失）和转染空载体细胞株L9981-PLXSN培养传代，应用蛋白印迹法（Western blot）和免疫沉淀法，检测应用U0126（40μmol／L，处理细胞20min）处理后三个肺癌细胞株中总ERK1／2和双磷酸化ERK1／2表达水平的变化；应用MTT法及改良Boyden小室法分别检测三个肺癌细胞株应用U0126处理后细胞体外增殖活性及侵袭能力的变化。结果L9981-nm23-H1细胞株磷酸化ERK1／2表达水平、ERK1／2相对活性经U0126处理后均显著低于L9981和L9981-PLXSN细胞株（P〈0．01），而L9981和L9981-PLXSN细胞株间磷酸化ERK1／2表达水平、ERK1／2相对活性比较均无显著性差异（P〉0．05）；三个肺癌细胞株总ERK1／2水平处理后比较均无明显变化，差异均无显著性（P〉0．05）；L9981-nm23-H1细胞株体外增殖能力及侵袭力均显著低于L9981细胞株和L9981-PLXSN细胞株（P％0．01）；U0126能显著下调L9981细胞株体外增殖活性及侵袭能力（P〈0．01）。结论阻断L9981细胞株中ERK1／2的激活后可发生与转染nm23-H1基因相似的细胞生物学行为的变化，即细胞的体外增殖能力及侵袭力均显著降低，提示nm23-H1基因转染逆转人高转移大细胞肺癌恶性表型的分子机制可能与其下调ERK1／2信号转导通路中关键激酶ERK1／2的活性有关。     

蛋白激酶C抑制剂Calphostin C抑制人高转移大细胞肺癌细胞株侵袭和转移的实验研究

[目的]探讨以蛋白激酶C（PKC）为靶点应用其特异性抑制剂开发抗肿瘤侵袭与转移靶向药物的可行性。[方法]应用MTT法和改良Boyden小室法分别检测三株肺癌细胞株细胞（L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1）的侵袭力、增殖力;以及加入Calphostin C作用后,三株细胞株细胞侵袭力、增殖力的变化。[结果]L9981和L9981-pLXSN体外侵袭力和增殖活性明显高于转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1肺癌细胞株（P〈0．001）;L9981和L9981-pLXSN细胞间体外侵袭力和增殖活性则无显著性差异（P〉0．05）。用Calphostin C处理三株肺癌细胞株后,细胞体外侵袭力和增殖活性显著下降（P〈0．001）,但L9981-nm23-H1细胞体外侵袭力和增殖活性仍低于L9981和L9981-pLXSN（P〈0．001）,而后两者细胞间则无显著性差异（P〉0．05）。[结论]PKC抑制剂Calphostin C可明显抑制L9981肺癌细胞株的细胞增殖力和侵袭力;Calphostin C和nm23-H1在影响人高转移大细胞肺癌细胞株细胞体外增殖活性和侵袭力的过程中具有协同和相加作用。     

nm23-H1基因逆转人高转移大细胞肺癌细胞L9981转移表型的分子机制

背景与目的:nm23-H1基因已被证明是转移抑制基因,转染野生型nm23-H1基因可以逆转肿瘤的恶性转移表型,但是nm23-H1基因抑制或逆转肺癌转移的分子机制却知之甚少,我们在建立转nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1的基础上,进一步探讨nm23-H1基因抑制肺癌转移的分子机制。方法:应用MTT法和改良的Boyden小室法分析转基因前后细胞的体外增殖能力及体外侵袭力的变化,体内实验分析转基因前后细胞在裸鼠体内的成瘤性及肺转移能力的改变,同时应用RT-PCR和Westernblot分别检测各组细胞中转移相关基因β-catenin、E-Cadherin、CD44S、CD44V6、MMP-2、TIMP-1、VEGF、基因mRNA及蛋白表达水平。结果:(1)转基因细胞株L9981-nm23-H1的体外增殖能力[(0%vs.(19.5±2.9)%]、克隆形成能力(10.3±0.7vs.21.7±1.3)及侵袭力显著低于L9981细胞(31.0±3.0vs.151.0±6.3)(P<0.01);(2)nm23-H1基因在裸鼠体内的抑瘤率显著增高(82.6%vs.0%),且转染nm23-H1基因的L9981细胞裸鼠体内移植瘤肺转移显著降低(0%vs.100%)(P<0.01);(3)nm23-H1基因能够上调β-catenin、E-Cadherin、TIMP-1基因mRNA及蛋白表达,下调VEGF、CD44V6和MMP-2基因mRNA及蛋白表达(P<0.01);(4)nm23-H1表达上调CD44S基因mRNA表达(P<0.01),而对其蛋白表达     

nm23-H1基因转染对肺癌L9981细胞黏附分子表达的影响

目的:探讨nm23-H1基因转染对肺癌L9981细胞黏附分子表达的影响。方法:利用细胞黏附实验、Boyden小室法研究转染前后肺癌L9981细胞黏附、侵袭能力的改变。分别利用逆转录-PCR(RT-PCR)和流式细胞术检测转染前后E-cadherin、integrin β1和integrin β3 mRNA和蛋白的表达。结果:转染后L9981细胞株黏附性以及侵袭性均降低。与转染空载体组相比,转染nm23-H1质粒后L9981细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达均增强,integrin β1和integrin β3 mRNA和蛋白表达均减弱,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论:nm23-H1基因具有逆转肺癌恶性转移表型的能力,其对肺癌L9981细胞株E-cadherin表达具有正调控作用,对integrin β1和integrin β3表达具有负调控作用。     

nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株的比较蛋白质组学研究

背景与目的肿瘤转移抑制基因nm23-H1基因调控肺癌细胞转移潜能的确切机理尚未明了,本研究旨在探讨人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和转染nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981-nm23-H1)的差异表达蛋白,为阐明肺癌转移的分子机制、发现早期诊断肺癌转移的分子标志和新的治疗靶点提供实验依据。方法应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离L9981和L9981-nm23-H1细胞株的总蛋白,对25个差异明显的蛋白质点进行质谱鉴定和生物信息学分析。结果研究观察到nm23-H1基因转染使人L9981细胞株蛋白质组的表达谱发生了明显变化:5个蛋白质表达缺失,9个新的蛋白表达,16个蛋白质表达下调,12个蛋白质表达上调。这些蛋白质主要涉及细胞骨架蛋白、信号转导蛋白、细胞代谢相关蛋白、发育增殖相关蛋白及肿瘤侵袭相关蛋白。结论 nm23-H1基因转染L9981后,蛋白质表达谱发生了显著的变化,这些差异蛋白质可能是逆转肺癌侵袭转移的生化基础,本研究结果可能为阐明肺癌转移的分子机制提供线索。     

nm23-H1基因转染对肺癌细胞MMP-9和TIMP-1表达的影响

目的 探讨nm23-H1基因转染对肺癌细胞株基质金属蛋白酶9（MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）表达的影响。方法 利用脂质体介导的基因转染技术,将nm23-H1基因转染入肺癌细胞株L9981;利用半定量RT-PCR技术检测nm23-H1基因转染前后L9981肺癌细胞株TIMP-1、MMP-9基因的mRNA表达;利用流式细胞仪技术检测nm23 H1基因转染前后L9981肺癌细胞株TIMP-1、MMP-9基因的蛋白表达。结果 nm23-H1基因转染后肺癌细胞株TIMP-1 mRNA及蛋白表达上调,MMP-9 mRNA及蛋白表达下调。结论 nm23-H1基因对L9981肺癌细胞株TIMP-1 mRNA与蛋白表达具有正向调控作用,对MMP-9 mRNA与蛋白表达具有负向调控作用。     

nm23-H1通过下调PKC信号通路抑制肺癌细胞侵袭

目的 探讨nm23-H1基因调控肺癌细胞PKC信号通路抑制肺癌侵袭和转移的分子机制。方法应用Western-blot、Boyden．Chamber、MTT法和激光扫描共聚焦显微镜技术分别检测nm23-H1基因转染前后以及PKC抑制剂Calphostin C处理前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞膜、胞浆PKC的分布变化;体外侵袭力和增殖力的变化;以及细胞中PKC激活转位变化和Ca^2＋浓度的变化。结果（1）L9981和19981-pLXSN细胞中PKCα、PKCβⅡ蛋白在胞膜的表达量明显较19981-nm23-H1增多（P〈0．001）,表明其处于活化状态的PKC明显增加;（2）PKCα、PKCβⅡ在L9981及L9981-pLXSN细胞中主要位于胞核、核周和质膜,明显处于激活转位状态;在L9981-nnd3-H1细胞中则主要位于胞浆内,处于无活性状态,前二者胞浆中Ca^2＋荧光表达强度显著高于后者（P〈0．001）;（3）19981-nm23-H1体外增殖力,侵袭力显著低于L9981和L9981-pLXSN（P〈0．001）,但后二者间比较差异无统计学意义（P〉0．05）;（4）抑制剂处理后,L9981和19981-pLXSN细胞中PKCα、PKCβⅡ在胞膜的蛋白表达量和胞浆中的Ca^2＋荧光表达强度均较处理前明显下降（P〈0．001）;3株细胞体外增殖力、侵袭力均较处理前明显下降（P〈0．001）。结论nm23-H1基因可能通过PKC信号通路来发挥其肿瘤转移抑制作用,细胞内钙离子可能参与了这一过程。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

nm23-H1 reduces in vitro cell migration and the liver metastatic potential of colon cancer cells by regulating myosin light chain phosphorylation

The nm23-H1 gene is known as a potential metastasis suppressor gene in various types of carcinomas. However, the role of nm23-H1 in colorectal carcinoma still remains controversial and the cellular mechanisms by which its protein may modulate the metastatic phenotype are not yet known. We transfected nm23-H1 cDNA into the human colon cancer cell line, HT-29, to test the effects and cellular biological mechanism of nm23 protein in colon cancer. We found that nm23-H1 strongly inhibited the liver metastasis of HT-29 cells in nude mice and inhibited the epidermal growth factor (EGF)-induced cell migration in vitro. Furthermore, we clarified the regulation of the myosin light chain (MLC) phosphorylation by nm23-H1, which has been demonstrated as having potential role in cell migration.