ArdipusillosideⅠ诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡实验研究

目的研究开发诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的新型抗肿瘤药物并探讨其机制。方法以U87MG、原代培养的人源性胶质母细胞瘤株和SVGp12细胞为研究对象,采用甲基噻唑基四唑（MTF）法检测ardipusilloside Ⅰ作用后细胞的增殖活性,通过流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst33342细胞核染色,透射电子显微镜观察ardipusillosideⅠ作用后细胞形态学的改变。Western blot检测细胞内FasL、Fas、caspase-8和caspase-3的蛋白表达情况。结果ArdipusillosideⅠ以时间和浓度依赖的方式显著抑制了人胶质母细胞瘤U87MG细胞和原代培养人源性胶质母细胞瘤细胞的增殖活性。随着时间的延长和浓度梯度的增加,处理组逐渐显示出典型的凋亡细胞形态学特征。ArdipusillosideⅠ明显地改变了胶质母细胞瘤的细胞周期。结论ArdipusillosideⅠ成功诱导了人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞和原代培养的人源性胶质母细胞瘤细胞发生凋亡。     

α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与RhoGTPas-es信号通路的活化相关

目的：探讨α‐突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡的分子机制。方法构建α‐Syn寡聚体诱导SH‐SY5Y细胞凋亡模型,流式细胞技术检测SH‐SY5Y细胞凋亡;免疫荧光检测SH‐SY5Y细胞内α‐Syn阳性包涵体;Pulldown检测SH‐SY5Y细胞Rac1、Cdc42、RhoA活性。结果与对照组相比,α‐Syn寡聚体诱导SH‐SY5Y细胞凋亡率显著增加,细胞内α‐Syn阳性包涵体数量增加,Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。结论α‐突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与RhoGTPases信号通路的活化相关。     

三氧化二砷诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡作用的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)及其联合地塞米松(DEX)诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的作用。方法实验分为空白对照组、As2O3组、DEX组、As2O3 DEX组,经倒置显微镜观察、吖啶橙荧光染色、流式细胞计数、细胞DNA片段断裂率来检测As2O3及其联合DEX诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的作用。结果As2O3以浓度依赖形式诱导BT-325细胞凋亡;DEX具有明显的协同效应。结论As2O3与DEX联合用药可能成为治疗胶质母细胞瘤的一条新途径。     

IFN-γ增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤的诱导凋亡作用

目的探讨细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y（SY5Y）细胞的作用及γ-干扰素（IFN-γ）对其抗瘤活性的影响。方法应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测IFN-γ作用前后半胱-天冬氨酸蛋白酶8（Caspase8）mRNA的表达;应用流式细胞仪检测细胞毒类药物[阿霉素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）]及IFN-γ联合细胞毒类药物对SY5Y细胞的诱导凋亡作用;应用比色法测定Caspase8相对活性。结果SY5Y细胞不表达Caspase8,经IFN-γ作用后Caspase8mRNA表达明显增加。SY5Y细胞对阿霉素相对敏感,对TNF-α和TRAIL不敏感;经IFN-γ预处理后,表达Caspase8的SY5Y细胞对三种细胞毒类药物的诱导凋亡作用敏感并伴随Caspase8活性增高,此作用可被Caspase8抑制剂所阻断。结论IFN-γ通过上调Caspase8表达而增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用。     

去甲基药、化疗药及TRAIL联合诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的探讨去甲基药5-氮杂胞苷、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及化疗药联合诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SYSY（SYSY）凋亡的作用及其发生机制。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测5-氮杂胞苷作用前后SYSY细胞caspase-8的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪检测TRAIL、5-氮杂胞苷＋TRAIL、5-氮杂胞苷＋caspase-8抑制剂zIETD-FMK＋TRAIL及5-氮杂胞苷＋化疗药＋TRAIL对SYSY细胞生长及凋亡的影响。结果SYSY细胞不表达caspase-8，5-氮杂胞苷作用1、3、5、7d的SY5Y细胞caspase-8表达逐渐增加。SY5Y细胞对TRAIL不敏感，经5-氮杂胞苷诱导表达caspase-8的SY5Y细胞对TRAIL敏感；化疗药可增强SYSY细胞对TRAIL的敏感性。结论5-氮杂胞苷可通过上调SYSY细胞caspase-8表达而逆转SYSY细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受，化疗药可进一步增强TRAIL对SYSY细胞的诱导凋亡作用。     

外源性bFGF抑制辐射诱导的C17.2神经干细胞凋亡的实验研究

目的 观察外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对辐射诱导的C17.2神经干细胞(NSCs)凋亡的影响,探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在bFGF对辐射诱导的C17.2 NSCs凋亡的抑制效应中的作用. 方法 以直线加速器照射C17.2NSCs建立离体放射性损伤模型.MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测不同浓度的外源性bFGF和U0126对细胞凋亡的影响. 结果 外源性bFGF浓度为0～100ng/mL时,细胞凋亡率可由(12.78±1.04)%降低至(4.83±0.31)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);加入U0126后细胞凋亡率为(8.42±0.71)%.DMSO对照组为(4.71±0.42)%,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 外源性bFGF对辐射引起的C17.2 NSCs凋亡具有抑制作用,ERK1/2参与该效应.     

外源性Bax基因过表达对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株Smac蛋白表达的影响

目的观察Bcl-2相关X蛋白（Bax）基因过表达对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞第二个线粒体来源的半胱氨酸酶的激活剂（Smac）蛋白表达的影响。方法采用脂质体Lipofectamine 2000将携带人Bax基因的过表达质粒转入SH-SY5Y细胞（转染组）,同时设空载体组和未转染组。通过G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆。Hoechst33258染色观察凋亡细胞,免疫印迹法法检测细胞中Bax、Smac蛋白表达,免疫荧光染色检测Bax、Smac蛋白在细胞中的分布。结果转染后用G-418持续筛选2周可获得G418抗性的细胞克隆。Smac主要分布于胞质,Bax主要位于细胞核。转染组SH-SY5Y细胞Bax蛋白表达水平（1.067±0.036）较空载体组（0.436±0.035）和未转染组（0.444±0.046）显著增高（P〈0.05）;转染组Smac蛋白表达水平（1.408±0.044）相比空载体组（0.708±0.021）和未转染组（0.748±0.041）显著增高（P〈0.05）;空载体和未转染组细胞Bax和Snac蛋白表达均无显著差异（P〉0.05）。转染组较未转染组细胞凋亡率显著增加（P〈0.05）。结论外源性Bax基因转入人神经母细胞瘤细胞中并稳定过表达,能够上调Smac蛋白表达,促进细胞凋亡。     

海葵毒素对神经胶质瘤细胞的凋亡诱导作用

目的 研究从海葵组织中提取的海葵毒素(Phyllodiscus semonii toxin,PsTX)对人神经胶质瘤细胞(U251)凋亡的诱导作用及其可能机制.方法 MTT法检测PsTX对肿瘤细胞的增殖抑制率;原位末端脱氧核糖苷肽转移酶分析法(TUNEL)及DNA Ladder法检测PsTX对肿瘤细胞的凋亡诱导作用;免疫组织化学染色显示Fas蛋白在U251细胞中的表达.结果 PsTX对人神经胶质瘤细胞具有明显的生长抑制及促凋亡作用,PsTX诱导Fas在人神经胶质瘤细胞膜上表达增高.结论 PsTX可能通过Fas途径诱导人神经胶质瘤细胞凋亡.     

microRNA-183通过下调Bcl-2诱导人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的研究

目的研究microRNA-183对神经母细胞瘤细胞的调控作用,为神经母细胞瘤的治疗提供新策略。方法购买microRNA-183和对照microRNA,转染至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞,再使用MTT实验,Caspase-3活性测定试剂盒和流式检测细胞生长和凋亡的影响。合成Bcl-2siRNA,检测Bcl-2对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞凋亡的影响。转染Bcl-2质粒后,再转染microRNA-183至人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞,分析Bcl-2的表达水平和人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞的凋亡。结果转染microRNA-183降低SK-N-SH细胞的生长(P=0.005 9),发生磷脂酰丝氨酸膜表面表达(P=0.008)和Caspase-3的激活(P=0.014),Bcl-2的表达降低(P=0.015)。干扰SK-N-SH细胞中Bcl-2增强了microRNA-183诱导的细胞凋亡(P=0.005 8),而过表达Bcl-2抑制了microRNA-183诱导的细胞凋亡(P=0.007 3)。结论转染microRNA-183抑制SK-N-SH细胞的生长和增殖。microRNA-183通过下调Bcl-2而诱导SK-N-SH细胞的凋亡,提示Bcl-2可能是神经母细胞瘤潜在的候选治疗靶点。     

神经干细胞研究现状及应用展望

一、神经系统发育与神经干细胞神经系统的发育起始于胚胎早期的神经管和神经嵴 ,其中央管在发育的终末形成脑室系统和脊髓的中央管 ,管腔内面被覆的细胞为神经上皮(ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ) ,具有活跃的增殖和分化能力 ,在胚胎早期此区域称为脑室 /脑室下区 (ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ/ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ ,ＶＺ/ＳＶＺ) ,而在成年后则称为室管膜 /室管膜下区 (ｅｐｅｎｄｙｍａｌ/ｓｕｂｅｐｅｎ ｄｙｍａｌｚｏｎｅ ,ＥＺ/ＳＥＺ) ,在神经发生(ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ)过程中起着举足轻重的作用。有关神经元和…     

亚低温对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响

目的 观察亚低温对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响.方法 制作SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型,分亚低温治疗组和对照组,组织原位凋亡检测法检测亚低温治疗期间第24、48、72小时,以及复温后第24、48、72、96和120小时的细胞凋亡情况,RT-PCR方法检测所有观察时间点促凋亡基因Caspase、Fas和凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表达水平.结果 亚低温治疗组脑组织的细胞凋亡数量在亚低温治疗期间的三个检测时间点均少于对照组(P＜0.05),复温以后逐渐增加,至复温后第72小时及以后细胞凋亡数量与对照组差异无统计学意义(P＞0.05);促凋亡基因Caspase、Fas和凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表达水平在亚低温治疗期间均低于对照组(P＜o.05),复温后出现mRNA表达的同向性升高,复温72 h及以后接近对照组(P＞0.05).结论 亚低温可明显减缓脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡进程,但在其复温后凋亡速度迅速回升.因此,应积极争取亚低温治疗时间窗,同步进行神经细胞救治.     

Bcl-2家族参与β-淀粉样蛋白对PC12细胞的致凋亡作用

目的：研究bcl一2家族(主要是bcl-xl和bax)基因及相关蛋白是否参与水溶性淀粉样蛋白对培养的大鼠嗜铬细胞瘤细胞的毒性作用。方法：应用电镜和DNA电泳判断细胞损伤途径，应用RT-PCR，免疫细胞化学和免疫印迹判断bcl-2家族及其相关蛋白是否参与淀粉样蛋白的损伤作用。结果：10μmol／LAβ25-35作用24h后，电镜和DNA电泳均显示Aβ25-35可以导致PCI2细胞凋亡；RT-PCR表明药物作用后6h，bcl-xl mRNA表达量减少而bax mRNA表达量增加；免疫印迹和免疫细胞化学结果显示药物作用后24h，Bax蛋白增加而Bcl-xl无明显改变。结论：水溶性淀粉样蛋白可以导致神经细胞凋亡，bcl-2家族参与了作用环节，对阿尔茨海默病的发病起着重要的作用。     

卡莫司汀对C6胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的研究卡莫司汀(BCNU)对胶质瘤凋亡的作用机制。方法取生长状态良好的C6胶质瘤细胞悬液,按1×107个细胞/25μl的密度接种于20只SD大鼠腹股沟区皮下,观察其生长情况。将16只成瘤大鼠随机等分为治疗组与非治疗组,前者按相同剂量隔日腹腔内注射BCNU。治疗2周后处死全部大鼠,取大鼠右侧腹股沟区皮下肿瘤行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色,检测胶质瘤的病理学特征及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、bax和bcl-2蛋白的表达情况,观察瘤细胞凋亡情况。结果C6胶质瘤细胞皮下接种4～5d后,大鼠腹股沟区皮下形成实体瘤;治疗2周,非治疗组和治疗组SD大鼠平均肿瘤质量差异有统计学意义(P<0.01),治疗组肿瘤抑制率为29.6%。肿瘤GFAP表达为阳性;BCNU治疗后bax基本无改变,bcl-2下调明显(P<0.01),bax/bcl-2比值明显增加。结论BCNU腹腔注射治疗大鼠神经胶质瘤导致胶质瘤细胞凋亡,其主要机制可能与下调凋亡蛋白bcl-2的表达和升高bax/bcl-2的比值有关。     

帕金森病脑内移植基因工程细胞系的构建

目的 为进行帕金森病（PD）的转基因细胞治疗，在实验室构建人类酪氨酸羟化酶（hTH）基因表达工程细胞系。方法 重组质粒pcDNA3/hTH经亚克隆、纯化后，用脂质体法转染到人类神经母细胞瘤细胞系SH－SY5Y细胞内，经G418筛选、克隆，分离培养经免疫细胞化学分析。结果 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞免疫细胞化学染色明显，与仅呈非特异性染色的对照组SH－SY5Y细胞形成鲜明的对比。结论 转染pcDNA3/hTH的SH－SY5Y细胞能够有效地表达hTH，在PD治疗的非人类灵长目实验中具有潜在的应用价值。     

胸苷激酶基因治疗人多形性胶质母细胞瘤BT325并诱导BT325和9L肿瘤细胞的凋亡

目的：了解转单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）前后胶质瘤细胞对更昔洛韦（ＧＣＶ）的药物敏感性；钙通道阻滞剂尼莫地平是否增强ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗的肿瘤杀伤作用，以及该治疗方法能否诱导胶质瘤细胞凋亡。方法：用带有ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因的重组逆转录病毒载体，转染人多形性胶质母细胞瘤株ＢＴ３２５。用ＭＴＴ法测定ＧＣＶ对转染ＨＳＶ－ＴＫ基因ＢＴ３２５瘤细胞的杀伤作用。结果：０．１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ对转ＨＳＶ－ＴＫ基因的ＢＴ３２５瘤细胞有杀伤作用，加入尼莫地平后，０．０１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ即有杀伤作用。同时发现该治疗方法可以引起胶质瘤细胞的凋亡。结论：ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗对胶质瘤有很强的杀伤作用，并可以引起肿瘤细胞的凋亡；尼莫地平有协同作用，这可能使尼莫地平做为一种增敏剂在脑肿瘤该治疗中使用。     

Ribozyme-mediated inhibition of caspase-3 activity reduces apoptosis induced by 6-hydroxydopamine in PC12 cells

6-Hydroxydopamine (6-OHDA) is a neurotoxin used in the induction of experimental Parkinson's disease in both animals and PC12 cells, which are derived from rat pheochromocytoma tumors and have many properties similar to dopamine neurons. Biochemical and molecular approaches have shown that low doses of 6-OHDA induce apoptosis in PC12 cells and, in the processing of apoptosis, caspases are crucial mediators, and caspase inhibition is sufficient to rescue PC12 cells from apoptosis induced by 6-OHDA. However, because this caspase inhibition targets multiple caspases, it is not known whether a single caspase is primarily responsible for effecting cell death in this model. To assess the particular member (caspase-3) of the ced-3 family relevant to cell death and to position their activation within the apoptotic pathway, we constructed a hammerhead ribozyme directed against rat caspase-3, which could downregulate the expression of caspase-3 in vitro and in vivo, and transfer to PC12 cells. The results show that the ribozymes against caspase-3 could protect PC12 cells from apoptosis induced by low doses of 6-OHDA. The PC12 cell transfected with the ribozymes shows a significant decrease in caspase-3 activity compared with control cells at various time points. Parallel to the reduced caspase-3 protease activity, similar decreased levels of apoptotic cells and DNA fragmentation were also assessed by staining with Hoechst 33258 and ELISA, respectively. Overexpression of p35, a general caspase inhibitor, also protected PC12 cells from apoptosis. These results confirm that caspases play an important role in 6-OHDA-induced PC12 cell apoptosis and indicate that caspase-3 itself is one of the crucial mediators of neurotoxin-induced PC12 cell apoptosis.     

脑缺血再灌注后血管内皮细胞凋亡及其与Bcl—2表达的关系

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后血管内皮细胞凋亡及其与Bcl-2蛋白表达的关系。方法 采用原位末端标记法和免疫组化法分别观察脑缺血再灌注2h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d和21d等时间 点血管内皮细胞凋亡和Bcl-2蛋白的表达。结果 （1）脑缺血再灌注2h在缺血周围区即有凋亡内皮细胞出现,12－24h达高峰,之后逐渐下降,至21d与假手术组已无显著性差异。（2）脑缺血再灌注后2h在缺血周围区内皮细胞Bcl-2开始表达,12－24h达高峰,之后逐渐下降,至14d接近假手术组水平。（3）Bcl-2蛋白表达时相变化与内皮细胞凋亡基本一致。结论 脑缺血再灌注损伤中凋亡是血管内皮细胞的死亡形式之一,Bcl-2蛋白具有抑制缺血再灌注后血管内皮细胞凋亡的作用。     

Down‐regulation of Bcl‐2 enhances autophagy activation and cell death induced by mitochondrial dysfunction in rat striatum

In vivo administration of the mitochondrial inhibitor 3‐nitropropionic acid (3‐NP) produces striatal pathology mimicking Huntington's disease (HD). However, the mechanisms of cell death induced by metabolic impairment are not fully understood. Previous studies showed that 3‐NP triggered p53‐depedent autophagy activation and cell death. The present study investigated the contribution of the Bcl‐2 signaling pathway to autophagy activation and cell death induced by 3‐NP. Rat striatum was intoxicated with 3‐NP by stereotaxic injection. 3‐NP up‐regulated the expression of the autophagic protein beclin 1 but down‐regulated the expression of the antiapoptotic protein Bcl‐2. Pretreatment with the autophagy inhibitor 3‐methyladenine (3‐MA) significantly inhibited the 3‐NP‐induced alterations in beclin 1 and Bcl‐2 protein levels. Similarly, the 3‐NP‐induced decline in Bcl‐2 was also prevented by the lysosomal inhibitor E64, indicating degradation of Bcl‐2 by lysosomes. In agreement with the time course of 3‐NP‐induced cell death, an increase in the release of cytochrome c from mitochondria was observed. 3‐MA also attenuated the 3‐NP‐induced release of cytochrome c. On the other hand, 3‐NP‐induced elevations in proapoptotic protein Bax and autophagic protein beclin 1 and LC3‐II were significantly enhanced by the Bcl‐2‐specific inhibitor HA14‐1. Furthermore, HA14‐1 increased the release of cytochrome c and 3‐NP‐induced striatal damage. These results suggest that induction of autophagy leads to degradation of Bcl‐2. Meanwhile, down‐regulation of Bcl‐2 amplifies autophagy activation and apoptotic signaling. Bcl‐2 thus plays important roles in mitochondria dysfunction‐induced apoptotic death of stritatal neurons by modulating both autophagic and apoptotic processes. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

细胞因子在淋巴细胞介导胶质瘤细胞凋亡中的作用

目的 细胞因子ＴＮＦ、ＩＦＮ等在淋巴细胞介导胶质瘤细胞凋亡方面的作用和特点。方法 采用免疫组化,分子生物学、ＭＴＴ法及ＰＢＬ对培养的胶质瘤细胞凋亡形成的直接观察方法。结果 正常人ＰＢＬ对Ｕ２５１ＭＧ的杀伤活性明显高于ＴＮＦ或ＩＦＮ的单独作用,ＩＦＮ＋ＰＢＬ组对Ｕ－２５１ＭＧ的杀伤作用较ＰＢＬ及ＴＮＦ＋ＰＢＬ组的杀伤作用凋亡细胞很少而核分裂相细胞多;ＰＢＬ＋ＩＦＮ组出现大量肿瘤细胞凋亡。结论 细胞凋