生物素标记的核酸分子杂交

用生物素代替同位素标记探针技术、NaAc－NaOH溶液代替Tris－Nacl中和液、脱脂奶粉代替Denhardt溶液和小牛胸腺DNA进行分子杂交。结果表明：经改进后的核酸分子杂交方法具有简便、安全、稳定、成本低的优点。     

一种简易的预杂交体系

一种简易的预杂交体系分子生物学研究室陈汉春，卿科云，杨友云关键词印迹法，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ；预杂交；核酸杂交；方法核酸分子杂交是一项基本的分子生物学研究技术。在进行核酸分子杂交反应之前，必须用含有某些大分子物质的预杂交液，对经核酸印迹转移（Ｓｏｕｔｈｅ...     

低脂奶粉在核酸蛋白质杂交中的应用

核酸、蛋白质分子杂交技术，是现代分子生物学领域中最常用的技术之一。由于近年来各种DNA探针商品化以及标记探针试剂配套化，给分子杂交技术的应用带来方便。然而在杂交过程中，杂交液的配制颇为复杂。我们所采用的低脂奶粉杂交液可替代传统的杂交液，在核酸及蛋白分子杂交中得到了较好的应用。1材料与方法1.1试剂：①低脂奶粉，上海产光明牌脱脂奶粉含脂肪1.5％，5％（W／V）奶粉悬液-20℃、保存；②20×SSC（3mol／L氯化钠、0.3mol／L柠檬酸钠），③预杂交液：0.5％奶粉液加6×SSC（核酸杂交），5％奶粉液加PBS（蛋白质杂交）；…     

钯卟啉探针与核酸相互作用的研究

目的:研究水溶性钯卟啉探针与核酸的相互作用。方法:采用室温磷光探针法研究阳离子探针Pd—TAPP和阴离子探针Pd—TSPP与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。结果:Pd-FAPP探针结合于DNA分子的浅沟槽处,缔合常数为KPd-TAPP-DNA=4.37×105L/mol。结论:Pd—TAPP与DNA分子间具有较高的亲和力,而Pd—TSPP由于带有负电荷,所以与DNA的亲和能力远弱于Pd-TAPP。     

用不同标记的乙型肝炎病毒DNA探针对肝组织内病毒基因进行原位核酸分子杂交

本文报道采用国产[α-(55)~S]dATP及进口[3~H]dNTP与生物素标记HBV DNA全基因探针进行原位核酸分子杂交,均可获得阳性结果。其中[3~H]dNTP标记探针的敏感性与特异性最佳。对6例慢性乙型肝炎患者肝组织切片进行原位核酸分子杂交,结果与肝组织提取物经Southern吸印转移HBV DNA杂交的阳性率完全一致。原位核酸杂交显影后的银颗粒呈灶性分布于肝细胞内,提示病毒在肝内扩散为细胞——细胞间传播方式进行。对1例有复制型HBV DNA的肝癌组织进行原位核酸分子杂交,发现HBV DNA主要分布在光镜下癌细胞旁肝细胞胞浆中,而癌细胞中未测得HBV DNA,其意义有待更多病例数检测后才能阐明。     

非同位素标记DNA探针的制备(简讯)

核酸分子杂交法广泛用于分子生物学研究,对遗传性疾病的探索、优生检查、法医侦破罪犯等都起到重要作用。在分子杂交中,DNA探针的制备是方法成功的关键。目前常用的是~(32)P或~(35)S标记的探针,但在国内高比活性的底物[α-~(32)P]-dATP或[α-~(35)S]-dATP都难得到,阻碍了分子杂交法的应用。 1981年Langer用dATP-生物素做底物,标记DNA,再与过氧化酶联的抗生物素结合,经酶反应显色检测。1983年Leary用碱性磷酸酶代替过氧化物酶,使检测的灵敏度提高了20～50倍,达到同     

大剂量维生素C对DNA损伤及槲皮素-7-硫酸酯钠的保护作用

目的 探讨大剂量维生素C(VC)对小牛胸腺DNA损伤及槲皮素-7-硫酸酯钠的保护作用.方法 小牛胸腺DNA用VC(0.1、0.25及0.50 mmol/L)预处理和用不同剂量槲皮素、槲皮素-7-硫酸酯钠(0.1、0.25、0.50 mmol/L)与VC(0.50 mmol/L)以不同方式处理(预处理、同时处理),采用琼脂糖凝胶电泳技术检测分析DNA电泳条带及用分光光度法检测分析DNA浓度变化情况.结果 低剂量VC组DNA条带及DNA浓度没有明显变化;中高剂量VC组DNA条带明显拖尾,DNA浓度显著升高;各浓度槲皮素-7-硫酸酯钠不同处理组DNA条带拖尾现象较VC损伤组均减弱,小牛胸腺DNA条带变亮,DNA浓度也有明显下降.结论 大剂量VC能直接损伤小牛胸腺DNA,槲皮素-7-硫酸酯钠对大剂量VC诱导的DNA损伤有保护作用,且呈明显浓度依赖关系.     

重组DNA技术与遗传病的产前基因诊断

重组DNA技术包括:限制性内切酶等工具酶的应用;核酸的分子杂交技术;重组DNA—基因工程和DNA分子中核苷酸顺序分析等。随着分子生物学的进展,重组DNA技术已从实验室研究发展成为     

HBV基因型与肝癌的预测性相关研究 Ⅰ.地高辛甙元标记HBV-DNA探针的制备

用地高辛甙元随机引物法标记HBV DNA探针,通过核酸分子杂交技术测试该探针。结果证实,该探针检测HBV DNA的特异性和敏感性均达到了实验要求,为进一步开展临床HBV核酸分子杂交检测技术提供了可靠的实验材科。     

β-榄香烯与核酸的结合作用

本文中用DNA热变性实验及荧光分析法研究了β-榄香烯与小牛胸腺DNA的结合作用．热变性实验表明β-榄香烯可使小牛胸腺DNA的热变性温度Tm值下降2℃，小牛胸腺DNA(30μg／ml)与β-榄香烯(20μg／ml)温育后．激发波长为3．4nm,发射波长为358nm,其荧光强度为0．315，此时小牛胸腺DNA(30μg／ml)的荧光强度仅为0．020,用酵母的t-RNA与-β-榄香烯实验也取得类似的结果。对β-榄香烯的抑癌机理用量子化学CNDO／2方法计算的结果进行了探讨。β-榄香烯的前沿轨道能级ELUMO=0．0168 au EHOMO=03239au鸟嘌呤的ELUMO=0．1629au其EHOMO=-0．25960au胸腺嘧啶的ELUMO=0．1324au．其EHUMO=0.3550au脲嘧啶的ELUMO-=0．0888au其EHOMO=-03940au。上述计算结果提示β-榄香烯与核酸碱基的前沿轨道之间的相互作用；因β-榄香烯上的一个甲基带有较正的静电荷，该甲基可能与核酸碱基上的氮原子存在分子间选择性疏水作用。     

STUDY ON GMA-DNA ADDUCTS

Objective. DNA modification fixed as mutations in the cells may be an essential factor in the initiation step of chemical ca~inogenesis. In order to explore the mechanism of gene mutation and cell transformation induced by glyaldyl methacrylate (GMA), the current test studied the characteristics of GMA-DNA adducts formation in vitro. Methods. in vitro test, dAMP, dCMP, dGMP, dTMP and calf thymus DNA were allowed to react with GMA (Glycldyl Methacrylate). After the reaction, the mixtures were detected by UV and subjected to reversed-phase HPLC on ultrasphere ODS reversed-phase column, the reaction products were eluted with a 1inear gradients of methanol (solvent A) and 10mmol/L ammonium formate, pH5.0 (solvent B).The synthesized adducts were then characterized by UV spectroscopy in acid (pH1. 0), neutral (pH7.2),alkaline (pH11.0) and by mass speetroacopy. Results. The results showed that GMA could bind with dAMP, dCMP, dGMP and calf thynms DNA by covalent bond, and the binding sites were specific (N6 of adenine, Na of cytosine). Meanwhile, a main GMA-DNA adduct in the reaction of GMA with calf thymus DNA was confirmed as N3 methaerylate-2-hydroxypropyl-dCMP. Conclusions. GMA can react with DNA and /or deoxynucleotide monophosphate and generate some adducts such as N6-methaerylate-2-hydroxypropyl-dAMP and N3 methacrylate-2 hydroxypropyl-dCMP,ets. Formation of GMA-DNA adducts is an important molecular event in gene mutation and cell transformation induced by GMA.     

蚂蚁提取液对DNA-蛋白质交联修复能力的研究

目的探讨蚂蚁提取液（antextract,AE）对DNA-蛋白质交联（DPC）的修复能力。方法以甲醛为染毒液,预处理小牛胸腺DNA和卵清蛋白混合液,使之形成DPC,再用不同浓度的AE处理,最后采用SDS—KCl沉淀法来检测不同处理组的DPC修复情况。结果当甲醛染毒浓度为0．544mol／L时,10μg／ml的小牛胸腺DNA和10μg／ml的卵清蛋白DNA-蛋白质交联程度最高;制备2％的AE时,选择pH7．6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为组织匀浆液,AE具有最强的DPC修复能力,且用pH3．6的柠檬酸一柠檬酸三钠缓冲液制备的AE也具有部分DPC修复能力;0．002％、0．02％、0．2％和2％的AE具有一定的DPC修复能力,且存在明显的浓度-效应关系。结论本研究确定了蚂蚁提取液制备过程中缓冲液的最佳pH值,并证明了蚂蚁提取液具有一定的DPC修复能力。     

用核酸杂交技术检测抗病毒i-RNA制剂中病毒核酸的残留及其在免疫小鼠体内的动态变化

以生物素化dUTP标记CI(?)、株基因组Hind Ⅲ酶切Y片段为探针,用核酸杂交技术检测抗HCMV-iRNA制剂中巨细胞病毒核酸的残留,同时用HCMV免疫小鼠观察病毒核酸在小鼠体内的存留时间。结果,HCMV DNA在小鼠体内的存留时间有明显的个体差异,而与HCMV DNA有同源序列的RNA在免疫后7天被清除。在4批来自羊肝、脾组织的抗HCMV-iRNA 制剂中,有3批查出HCMV核酸。     

基于核酸保护原理的DNA芯片检测技术

目的：制备出3－末端与载玻片交联,5－末端用32P标记的检测DNA的芯片。方法：以化学法合成了3－末端为尿嘧啶核糖的寡聚脱氧核糖核苷酸片段,用32P标记寡核苷酸的5－末端,经过高碘酸氧化后与玻璃基片表面的脂肪胺基缩合,并用硼氢化钠还原,制成寡核苷酸3－末端与玻片共价交联,5－末端为同位素标记的DNA芯片,将芯片与液相中的核酸片段杂交,再用酸酶S1酶切,结果,当液相中的核酸与玻片上共价交联的寡核苷酸片段产生特异性杂交配对时,核酸酶S1不能酶切玻片上的寡核苷酸片段,且玻片上被保护的寡核苷酸量与液相中的与核酸,由于该法制备的DNA芯片各个位点的DNA探针的含量为已知,待测的核酸样品无需进行同位素或荧光标记,操作简便,适用于对样品的DNA或RNA进行检测。     

Characterization of the human DNA polymerase delta catalytic subunit expressed by a recombinant baculovirus

The catalytic subunit of human DNA polymerase (pol) delta, p125, was expressed in recombinant baculovirus-infected insect cells, separated from a baculovirus-encoded DNA polymerase, and was purified to homogeneity by affinity trapping with a histidine-octapeptide at the C-terminus of p125 as the ligand. Purified p125 showed DNA polymerase activity resembling conventionally purified calf thymus pol delta. However, the two differed in four ways: 1) the specific activity of recombinant p125 was one quarter of the calf thymus pol delta; 2) the recombinant p125 was relatively resistant to aphidicolin; 3) the apparent Km for dTTP of the recombinant p125 was estimated at 33 microM, 15-fold the value for calf thymus pol delta; and 4) the recombinant p125 was not stimulated by recombinant PCNA, while activity of calf thymus pol delta increased 150-fold in response. Furthermore, PCNA did not stimulate either the p125 incubated with p50, a small subunit of pol delta, or co-expressed with p50 in insect cells. The full length recombinant p125 migrated slightly faster than pol delta from human cell lines, Jurkat or HeLa, upon SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, suggesting a post-translational modification. The results indicate that in vivo assembly of the fully active complex of pol delta requires factors in addition to p125 and p50 subunits, and/or a post-translational modification of p125.     

~(35)S标记探针在核酸分子杂交上的应用

以[α-(35)~S]脱氧腺苷三磷酸(dATP)进行缺口平移制备~(35)S-cDNA_(AFP)探针,试与人肝癌染色质DNA作点状杂交实验,得到阳性结果。~(35)S具有半衰期长,使用安全的优点。[α-~(35)S]dATP已在国内试制成功,容易得到,有推广用于核酸分子杂交实验的价值。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

溴乙锭荧光法测定环境污染物的DNA交联作用

目的：评价溴乙锭荧光法检测食用油烟、香烟烟气、蚊香烟气颗粒提取物、氧化型染发剂、硝基苯类化合物的ＤＮＡ交联作用。方法：ＤＮＡ交联溴乙锭荧光分析法（ＥＦＡ）基于双链间交联所致的ＤＮＡ在变性条件下不解链，与溴乙锭结合可产生较强荧光，而正常ＤＮＡ变性后形成的单链ＤＮＡ无此现象的原理对ＤＮＡ交联进行测定。结果：食用油烟和香烟烟气颗粒提取物、氧化型染发剂具有致小牛胸腺ＤＮＡ交联形成的作用，具有遗传毒性的蚊香烟气颗粒提取物和２，４－二硝基甲苯和间二硝基苯等硝基苯化合物未观察到致ＤＮＡ交联作用。结论：ＤＮＡ交联溴乙锭荧光方法灵敏、快速、简便，适用于对环境污染物ＤＮＡ损伤机制的研究。     

磷酸钙沉淀法在HPV-18 DNA转染NIH 3T3细胞中的应用

以 HPV-18 DNA 为供体、小牛胸脉 DNA 为载体,NIH 3T3细胞为受体细胞,应用磷酸钙沉淀法将供体 DNA 引入细胞内,得到了清晰的 NIH 3T3细胞形态学转化灶。