共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒研究

目的 构建共表达中国株HIV-1 gp120与人白细胞介素6(IL-6)的重组鸡痘病毒。方法 分别将HIV-gp120基因和hIL-6基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL复合启动子ATI-P7．5和P7．5串联启动子下游，构建重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GP-IL6。利用脂质体法将重组质粒和鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞。经BUdR加压筛选3次后，重组病毒分别用PCR、间接免疫荧光试验和Western blot进行鉴定，并进行小鼠免疫研究。结果重组病毒基因组中可扩增出1．4kb大小片段，重组病毒感染细胞表面有绿色荧光物质，表达产物的Western blot分析表明重组病毒可表达gp120和hIL-6蛋白。重组病毒可刺激小鼠产生特异性体液免疫应答。结论成功构建了共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒，为研制HIV-1基因工程活载体疫苗提供有益的资料。     

HIV-1重组核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫应答的研究

目的：研究白细胞介素6（IL－6）对人类免疫缺陷病毒（HIV）gp120基因免疫小鼠的调节作用。方法：构建表达中国流行株HIV－1B亚型gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV－1B亚型gp120基因与IL－6基因的核酸疫苗质粒pGPIL-6，检测其在哺乳动物细胞中的表达并 将上述两种质粒注射Balb/c鼠，检测小鼠产生的CD4^ 和CD8^ T细胞数情况及诱导CTL反应能力。结果：以间接免疫荧光法（IFA）检测到gp120在哺乳动物细胞中得到表达。pGPIL-6免疫鼠，小鼠产生的CD4^＋和CD8^ T细胞数及诱导产生CTL反应的能力明显高于单纯注射gp120的小鼠。结论：协同应用IL－6基因可明显加强HIV－1gp120基因免疫效果，为中国流行株HIV－1核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

含中国流行株HIV—1Gag—gp120融合蛋白的重组鸡痘病毒的构建

目的用重组鸡痘病毒表达中国流行株HIV-1Gag-gp120融合蛋白.方法在以鸡痘病毒282E4株为基础构建的重组表达质粒pUTAL的ATI-P7.5复合启动子下游,插入编码中国流行株HIV-1Gag-gp120嵌合基因,构建了重组表达质粒pUTALGP.重组质粒与FPV共转染CEF细胞,进行了同源重组.通过PUdR加压筛选,X-gal染色,获得重组鸡痘病毒vUTALGP.结果经Westernblot检测表明,重组病毒表达了Gap-gp120融合蛋白,其分子量分别为110×103、69×103、48×103、24×103.电镜观察可见Gag蛋白在CEF细胞中形成的反转录病毒样粒子.重组病毒免疫小鼠,能够诱导HIV-1特异的血清抗体反应.结论重组鸡痘病毒成功的表达了Gag-gp120融合蛋白,并进行了正确的加工.     

共表达HIV-1与IL-6核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫原性的研究

目前我国ＡＩＤＳ的流行已进入快速增长期 ,因此应用现代生物技术研制新型ＡＩＤＳ疫苗 ,改进早期开发疫苗的缺陷 ,提高其质量是当前的迫切任务。本研究利用分子生物学方法在真核表达载体基础上构建ＨＩＶ结构基因与细胞因子ＩＬ 6基因共表达重组质粒作为核酸疫苗 ,进行小鼠免疫试验 ,探讨核酸疫苗对机体细胞免疫反应能力及细胞因子ＩＬ 6作为免疫佐剂的效果。构建表达中国流行株ＨＩＶ 1Ｂ亚型ｇｐ12 0基因的核酸疫苗质粒ｐＧＰ及共表达中国流行株ＨＩＶ 1Ｂ亚型ｇｐ12 0基因与ＩＬ 6基因的核酸疫苗质粒ｐＧＰＩＬ 6 ,检测其在哺乳动物细胞…     

狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫

目的 构建狂犬病毒糖蛋白重组鸡痘病毒，研究联合运用重组病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果，为狂犬病疫苗的研究提供基础。方法 以中国鸡痘病毒疫苗株282E4为基础构建的表达载体pUTA-2的ATI-P7．5复合启动子下游，插入狂犬病毒CTN-18l株糖蛋白基因，构建了重组转移载体pUTA-RgC。以脂质体转染法将pUTA-RgC转染至已感染鸡痘病毒282E4株(FPV)2～3h的鸡胚成纤维(CEF)细胞中。待细胞出现明显病变后收获病毒，用BrdU进行连续3次加压筛选，挑取蚀斑毒株、纯化、扩增，间接免疫荧光鉴定。用重组鸡痘病毒vUTA-RgC单独及与核酸疫苗联合免疫小鼠，在细胞及体液免疫，攻毒保护水平评价所构建的重组病毒及联合免疫效果。结果 间接免疫荧光结果表明已成功构建重组鸡痘病毒，免疫后能诱导机体产生细胞与体液免疫，并能抵抗标准攻毒株的攻击，联合免疫效果较为理想。结论 获得一株能够表达狂犬病毒糖蛋白的vUTA．RgC，并证明有一定的免疫原性，与核酸疫苗联合应用能够克服各自的缺点。     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。     

共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察

目的：构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株，并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16 E6和E7基因的重组痘苗病毒。该病毒免疫C57BL／6小鼠后，检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况。结果：PCR结果显示，重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7．5K表达的ME6和ME7－1基因。动物实验结果表明，rVmE6E7在C57BL／6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生，被免疫小鼠能够抵抗HPV16 E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击。结论：获得1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株，为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础。     

共表达HIV-1 gp120与IFN-α重组鸡痘病毒诱导特异性CTL的初步研究

目的:探讨共表达HIV -1gp12 0与IFN- α重组鸡痘病毒诱导小鼠产生特异性的CTL杀伤活性。方法:将重组鸡痘病毒经肌肉注射免疫BALB c小鼠后,制备小鼠脾淋巴细胞悬液。以免疫小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞,以表达HIV- 1结构蛋白的P815细胞为靶细胞,用乳酸脱氢酶释放法测定免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性。结果:重组病毒可有效地诱导特异性CTL的产生,且重组病毒免疫组小鼠脾特异性CTL对靶细胞的杀伤活性显著高于FPV对照组(P <0 .0 1)和PBS对照组(P <0. 0 1)。结论:共表达HIV- 1gp12 0和IFN -α的重组鸡痘病毒可激发强烈的细胞免疫,可作为我国HIV- 1疫苗候选株。     

含密码子优化型HIV-1 gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

目的 构建能表达野生型和密码子优化型人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)B亚型中国流行株gp120基因的非复制型腺病毒。方法 按哺乳动物细胞偏好的密码子对HIV-1B亚型中国流行株Ch gp42的gp120基因进行优化，合成优化基因。将野生型和密码子优化的gp120基因插入穿梭质粒，再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E．coli BJ5183，获得重组子，转染293细胞后获得重组病毒。分别以两种重组腺病毒疫苗免疫小鼠，ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体，乳酸脱氢酶法检测小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果 获得两株重组腺病毒rAd-wt．gp120和rAd．mod．gp120，能正确表达Gp120。rAd-mod．gp120比rAd-wt．gp120蛋白表达水平明显提高。重组腺病毒免疫小鼠后能产生HIV-1特异性的抗体及CTL反应，rAd-mod．gp120组明显优于rAd-wt．gp120组。结论 成功构建了表达野生型和密码子优化的HIV-1 gp120基因的重组腺病毒，能诱导HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。     

Construction and characterization of recombinant fowlpox virus coexpressing HIV-1(CN) gp120 and IL-2

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has now become one of the most serious infectious disease in the world, the safe and effective AIDS vaccines would be the best tools to control the disease. Fowlpox virus has been studied recently as a potential vector for the delivery of heterologous vaccine antigen. In this study, a recombinant fowlpox virus coexpressing gp120 of Chinese prevalent HIV-1 strain and IL-2 was constructed and the cellular immune responses against HIV-1 gp120 in BALB/c mice were evaluated. Chinese vaccine strain 282E4 of fowlpox virus was used as the vector to construct the recombinant fowlpox virus (rFPV) coexpressing HIV-1 gp120 and IL-2 via homologous recombination, and the recombinant virus was identified by PCR and Western blotting. The specific DNA fragment was amplified by PCR from the genomes of rFPV. Western blotting analysis showed that HIV-1 gp120 and IL-2 was expressed not only in chicken embryo fibroblast (CEF) cells infected by rFPV, but also in mammalian cells infected by rFPV. After the recombinant fowlpox virus was inoculated into BALB/c mice, specific CTL activities in the immunized mice were detected in the spleen. The results demonstrated that rFPV had good immunogenicity and could induce BALB/c mice to produce specific cellular immunity. IL-2 played a role of immunoadjuvant and enhanced the cellular immune response. The study provides the basis for the preparation of a Chinese vaccine candidate against HIV-1.     

Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性

目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。     

IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

目的 :探讨IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法 :构建含IL 18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠 ,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果 :联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组 (P <0 .0 5 ) ,空白质粒对照组 (P <0 .0 1)和PBS对照组 (P <0 .0 1)。结论 :IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫 ,且IL 18发挥了免疫佐剂的作用。     

共表达HIV-1 gag-gp120与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫研究

目的探讨共表达HIV-1 gag-gpl20与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法以重组鸡痘病毒首免，以表达相同抗原的核酸疫苗质粒追加免疫，检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果联合免疫组脾特异性CTL杀伤活性比重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组、鸡痘病毒疫苗株对照组和空白质粒对照组高，血清抗体水平显著高于空白质粒对照组和鸡痘病毒疫苗株对照组，但与重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组之间差异无显著性。结论重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫可诱导小鼠产生更强的细胞免疫应答。     

HIV-1 DNA vaccine efficacy is enhanced by coadministration with plasmid encoding IFN-alpha

Numerous strategies have been employed in an attempt to improve the immunogenicity and efficacy of nucleic acid vaccines. In the present study, the immunogenicity in the induction of humoral and cellular immune responses to HIV-1 DNA vaccine expressing a chimeric gene of gag and gp120 and the adjuvant effect of IFN-alpha on HIV-1 DNA vaccine were studied in a murine model. The DNA vaccine plasmid pVAX1-gag-gp120 and eukaryotic expression plasmid pVAX1-IFN were constructed by inserting the chimeric gene of gag and gp120 of HIV-1 and IFN-alpha into the downstream of CMV promoter of eukaryotic expression vector pVAX1, respectively. In vitro expression detected by RT-PCR and Western blotting showed that the genes of interest could be expressed in transfected HeLa cells. After BALB/c mice were immunized by three intramuscular inoculations of the HIV-1 DNA vaccine plasmids alone or in combination with IFN-alpha expression plasmids, the different levels of anti-HIV-1 humoral and cellular responses were measured comparable to the control groups immunized with pVAX1-IFN, parent plasmid pVAX1 or PBS. The percentage of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ subgroups of spleen T lymphocytes and the specific cytotoxicity activities of splenic CTLs in the coinoculation group were significantly higher than those in the separate inoculation group, and an enhancement of antibody response was also observed in the coinoculation group compared with the separate inoculation group. Take together, coadministration of HIV-1 DNA vaccine plasmids and IFN-alpha expression plasmids can elicit stronger humoral and cellular immune responses in mice than HIV-1 DNA vaccine plasmids alone, and IFN-alpha can be an effective immunological adjuvant in DNA vaccination against HIV-1.     

乙型肝炎病毒外膜蛋白和核壳蛋白双表达质粒的构建和表达

目的 构建同时表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的真核表达质粒并研究其表达效果.方法 利用DNA重组技术,构建由两个CMV启动子分别表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的双表达真核质粒VR-SC,体外真核表达后ELISA检测HBsAg和HBeAg.结果 在乙肝病毒外膜蛋白表达质粒上插入多克隆位点,并插入乙肝病毒核心蛋白的完整表达调控单元,体外真核表达后成功检测到HBsAg和HBeAg.结论 成功构建双表达质粒vR-sc,其表达效果良好,为进一步改造成HBV DNA疫苗打下了基础.     

携人IL-12基因腺病毒的构建及其对Hep3B细胞增殖及TGF-β表达的影响

目的:构建携带人IL-12的重组腺病毒,观察其对Hep3B增殖及TGF-β表达的影响。方法:PCR扩增IL-12基因,构建穿梭质粒pAdTrack-IL-12;穿梭质粒经Pme I线性化后转化AdEasier Cell,E.coli BJ5183内同源重组;PacⅠ酶切重组腺病毒质粒,转染AD293,包装病毒;病毒pAd-IL-12感染肝癌细胞Hep3B,以RT-PCR、Western blot检测白介素12的表达;MTT法检测肝癌细胞的增殖情况;RT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)的表达。结果:成功构建携IL-12基因的重组质粒,并成功包装可高效感染Hep3B的腺病毒pAd-IL-12;RT-PCR以及Western blot结果表明,病毒pAd-IL-12感染Hep3B后可高表达白介素12,并且与对照组相比Hep3B增殖能力显著降低(P<0.05),TGF-β表达量也降低(P<0.05)。结论:可高表达IL-12的腺病毒包装成功,感染肝癌细胞Hep3B后抑制其增殖,同时也下调TGF-β的表达,为进一步研究IL-12的肿瘤治疗作用奠定了基础。