脂多糖对大鼠脑微血管内皮细胞通透性的影响及机制研究

目的：了解脂多糖（LPS）对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)通透性的影响及其可能的机制。方法：分离和培养原代大鼠BMECs,随机分为对照组和LPS干预组。利用跨内皮细胞电阻抗检测 BMECs 屏障功能,Pull-down法测定RhoA活性,Western blot检测p115RhoGEF和紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的蛋白表达量。结果：与对照组（159.0±8.6 Ω?cm2）比较,LPS作用3 h后,大鼠BMECs 跨内皮细胞电阻抗值明显下降(108.3±4.2 Ω?cm2),作用12 h后达最低(85.4±2.5 Ω?cm2)。LPS作用5 min后RhoA明显活化,1 h后出现p115RhoGEF蛋白表达上调,3 h后紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平均不同程度下降,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：LPS诱导大鼠BMECs中p115RhoGEF/RhoA信号通路活化,导致紧密连接蛋白表达水平降低,引起 BMECs 通透性增加。     

缺氧对鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物的影响

目的：探讨缺氧对体外培养鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator, TPA)的影响。方法：分别对新生小鼠脑微血管内皮细胞进行原代和传代缺氧条件下培养,常规培养作为空白对照,每组各取8例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA活性。结果：原代培养内皮细胞空白对照组、缺氧组分泌TPA活性分别为(19.4±1.7)×10-2 IU/ml,(22.5±1.5)×10-2 IU/ml,两者有显著性差异(P0.05)。结论：体外培养鼠脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA;缺氧状态下原代培养内皮细胞产生的TPA活性增高。内皮细胞分泌的TPA可能是脑缺氧缺血致不可逆神经元损伤的一个重要媒介。     

RhoA-Rock信号通路抑制剂对缺氧人肺微血管内皮细胞丝状肌动蛋白细胞骨架的影响

目的 用RhoA-Rock信号通路抑制剂探讨肺出血时肺微血管内皮细胞的调控因素.方法 人肺微血管内皮细胞常规培养,分为4组:对照组、抑制剂组、缺氧组和抑制剂缺氧组.异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽与胞浆内丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)结合而发出红色荧光,共聚焦显微镜扫描观察F-actin的变化情况并记录相应荧光值.结果 细胞缺氧组1h、12 h和24h的F-actin平均荧光强度分别为对照组的(64.3±5.5)％、(60.3±4.2)％和(47.8±4.6)％;抑制剂缺氧组1h、12 h和24h分别为对照组的(66.2±3.2)％、(67.1±6.2)％和(72.5±6.1)％.细胞缺氧组缺氧1h后,F-actin平均荧光强度降低[(64.3±5.5)％],与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),至缺氧24h,F-actin含量已下降至对照组的(47.8±4.6)％,差异有统计学意义(P＜0.05).抑制剂缺氧组缺氧1h后,F-actin平均荧光强度较缺氧组1h有所升高,为对照组的(66.2±3.2)％,抑制剂组缺氧24h后F-actin平均荧光强度为对照组的(72.5±6.1)％,与缺氧组缺氧24h相比差异有统计学意义(P＜0.05).而抑制剂组不经缺氧的F-actin平均荧光强度与对照组相比无显著变化(P＞0.05).缺氧后细胞皮质状结构消失,应力纤维排列紊乱,随着缺氧时间的延长,F-actin逐渐解聚断裂.用RhoA-Rock信号通路抑制剂预处理细胞后再缺氧,核周围F-actin所形成的皮质状结构重新出现,细胞浆内应力纤维的排列和分布趋向于规律,F-actin断裂减少.结论 RhoA-Rock信号通路在肺微血管内皮细胞缺氧过程中介导了F-actin的损伤,用RhoA-Rock信号通路抑制剂干预可以为新生儿肺出血的治疗研究提供一个新的方向.     

激光共聚焦扫描显微镜检测缺氧人肺微血管内皮细胞丝状肌动蛋白的变化

目的研究人肺微血管内皮细胞丝状肌动蛋白(F-actin)在缺氧前后的变化,探讨在血管内皮细胞水平研究新生儿肺出血机制的方法。方法人肺微血管内皮细胞常规培养,分为对照组和1、2、4、6、12 h和24 h缺氧培养组,每组设8个复孔,异硫酸氢荧光素-鬼笔环肽与胞浆内F-actin结合而发出红色荧光,共聚焦显微镜扫描观察F-actin的变化情况并记录相应荧光值。结果缺氧1 h组F-actin平均荧光强度明显降低,为对照组的66.3%±5.3%,差异有统计学意义(P<0.05),缺氧24 h F-actin含量下降至对照组的47.1%±6.9%。缺氧后,细胞变得狭长,细长的丝状伪足明显可见,核周F-actin的分布明显减少,皮质状结构消失,应力纤维排列紊乱或部分消失,随着缺氧时间的延长F-actin逐渐解聚断裂。结论通过观察缺氧前后肺血管内皮细胞F-actin变化,可以为在内皮细胞水平研究新生儿肺出血发病机制提供实验研究基础。     

重组人白细胞介素-10对缺氧条件下人肺微血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究低氧条件下,重组人IL-10(rhIL-10)对人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性的影响。方法常规培养HPMVEC细胞株,分为5组:正常对照组(常规培养);缺氧对照组(50 mL·L-1CO2,950mL·L-1N2);缺氧培养并加入rhIL-10,并按rhIL-10剂量(10×103ng.L-1、50×103ng.L-1、100×103ng.L-1)分为rhIL-10低剂量干预组、rhIL-10中剂量干预组、rhIL-10高剂量干预组。培养4 h、12 h、24 h、48 h离心收集细胞,化学比色法检测细胞核内Caspase-3活性,24 h核荧光染色并在荧光显微镜下观察荧光强度,并进行统计学分析。结果 4 h,凋亡蛋白Caspase-3相对活性各组间无明显差异(P>0.05);12 h,缺氧对照组,rhIL-10低、中剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),rhIL-10高剂量干预组与正常对照组比较无明显差异(P>0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较显著降低(Pa<0.05);24 h,缺氧对照组、rhIL-10各剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa<0.05);48 h,缺氧对照组和rhIL-10低剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa>0.05);缺氧凋亡峰值见于24 h。24 h,各组行凋亡细胞核Hoechst荧光染色,缺氧对照组和rhIL-10低、中、高剂量干预组灰度值与正常对照组比较均显著升高(Pa<0.05);rhIL-10低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较显著降低(Pa<0.05)。结论缺氧可促进HPMVEC凋亡,rhIL-10可一定程度地抑制HPMVEC凋亡,这些变化可能与急性缺氧性各器官疾病密切相关。     

重组hpAKP逆转录病毒载体的构建及其在新生小鼠脑内的表达

目的：　探索逆转录病毒载体 (RV)作为新生儿神经系统疾病基因治疗载体的可行性及靶基因在其脑内表达特点。方法：　将从质粒DAP获得的报告基因人胎盘碱性磷酸酶 (hpAKP)克隆至RVpLXSN,用脂质体转染法导入包装细胞系PT67,获得高滴度的重组病毒。将其注射入生后1d的小鼠脑内,通过原位杂交、酶组化法,检测hpAKP在新生小鼠脑内的表达。通过免疫组化法,确定所转染细胞的种类。 结果：　注射后,新生鼠脑内hpAKP表达渐增高,但28d表达已较前减弱。RV转染的细胞位于皮层的Ⅱ～Ⅴ层锥体细胞、脑干神经核,小脑Purkenje细胞层,脑血管壁,脑膜及室管膜细胞等处。绝大多数细胞GFAP(+),少数GFAP(-)细胞也有转染,未见RV对神经系统的损害。结论：　RV可高效广泛转染包括神经元在内的新生小鼠脑细胞,靶基因表达正常,RV适于作为新生动物神经系统疾病基因治疗的载体。