柚皮素增强抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用

探讨柚皮素增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用及可能机制。MTT法检测柚皮素及抗人DR5单抗对人肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用;Annexin V/PI双染分析细胞凋亡;蛋白免疫印记检测Caspase 8的表达;流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达。结果显示,10 mg/L的mDRA-6作用于HepG2细胞12 h后细胞增殖抑制率为39%;10 mg/L的mDRA-6分别与200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞后细胞增殖抑制率分别增加至58%、79%、85%;Annexin V/PI双染及流式细胞术检测结果表明,2 mg/L的mDRA-6作用细胞12 h后细胞凋亡率为16%,2 mg/L的mDRA-6和400μmol/L柚皮素共同作用于HepG2细胞12 h后细胞凋亡率增加为63%;mDRA-6和柚皮素共同作用于HepG2细胞后,蛋白免疫印记结果显示Caspase 8的激活片段明显显现,流式细胞术检测HepG2细胞表面DR5的表达,其基础表达率为49%,400μmol/L柚皮素作用于HepG2细胞12后,HepG2细胞表面DR5的表达率增加为81%。实验显示柚皮素可增强抗人DR5单克隆抗体对人肝癌细胞系HepG2的凋亡作用,其可能机制为柚皮素诱导HepG2细胞表面DR5受体表达上调所致。     

抗人DR5单抗与阿霉素联合对人肝癌细胞SMMC-7721协同杀伤效应

目的：探讨mDRA-6对肝癌细胞系SMMC-7721致凋亡作用，及阿霉素与mDRA-6联合协同杀伤效应与机制。方法：常规培养肝癌细胞SMMC-7721，流式细胞术检测细胞表面DR5的表达率。Hoechst33258染色观察SMMC-7721细胞形态变化；MTT法检测细胞毒性作用；流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果：（1）mDRA-6能够诱导SMMC-7721细胞凋亡，在1.89μg／ml浓度下可杀伤36％的细胞，增加mDRA-6浓度，凋亡作用无明显增加；（2）SMMC-7721细胞对阿霉素敏感，存在浓度依赖性；（3）阿霉紊与mDRA-6联合对SMMC-7721细胞具有协同杀伤作用，2μg／ml的mDRA-6与40ng/ml的阿霉素联合杀伤印％SMMC-7721，Hoechst 33258染色和AnnexinV／PI染色证实杀伤作用是通过细胞凋亡实现的。结论：mDRA-6能够诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，阿霉素与mDRA-6联合具有协同作用。     

抗人DR5单克隆抗体对人肝细胞系HL7702的凋亡作用

目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA6)对人肝细胞系HL7702致凋亡的作用。方法:流式细胞术检测HL7702细胞表面DR5的表达。在荧光显微镜下观察mDRA6对HL7702细胞形态变化的影响;MTT法检测mDRA6的细胞毒性作用;AnnexinVFITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:mDRA6导致HL7702细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征;MTT法检测显示在40mg/L浓度下可杀伤39%的细胞;经流式细胞术检测显示,3mg/L的mDRA6作用HL7702细胞6h导致25.5%的细胞发生凋亡。结论:mDRA6能够诱导人肝细胞系HL7702凋亡,mDRA6具有诱导细胞凋亡的活性。     

抗人DR5单克隆抗体——mDRA-6与顺铂协同杀伤白血病细胞HL-60作用研究

目的：观察抗死亡受体5（Death receptor 5,DR5）单克隆抗体--mDRA-6与顺铂（DDP）对HL-60细胞的协同杀伤作用.方法：DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗DR5单抗--mDRA-6;流式细胞术测定顺铂对HL-60细胞表面DR5表达及细胞凋亡率;荧光显微镜下观察mDRA-6与顺铂协同作用下HL-60细胞形态变化;MTT法测定不同浓度的顺铂与mDRA-6对HL-60细胞存活的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6与顺铂联合对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果：顺铂可诱导HL-60细胞表面DR5表达增加,mDRA-6与顺铂联用致HL-60细胞出现染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成等细胞凋亡形态学变化;250 ng/ml的mDRA-6作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为16.61%;0.16 μg/ml的DDP作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为2.35%;二者联合作用后,HL-60细胞凋亡率增至57.10%;mDRA-6与DDP联合作用HL-60细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显“梯形”条带.结论：抗DR5单抗--mDRA-6与DDP对HL-60细胞具有强大的协同杀伤作用.     

死亡受体5在内毒素诱导人肝细胞凋亡中的作用

探讨内毒素(LPS)在体外直接作用于LO2细胞引起凋亡及可能机制。将LO2细胞常规培养7 h贴壁后,分为对照组、内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组及联合组(内毒素+mDRA-6)。然后在倒置显微镜下观察LO2细胞形态变化;MTT法检测内毒素对LO2细胞生长的影响;流式细胞术检测LO2细胞表面DR5的表达率;Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡率。结果:经内毒素处理的LO2细胞呈现明显的凋亡形态特征,出现核固缩、染色质边缘化、凋亡小体形成。流式细胞术分析表明:对照组LO2细胞表面DR5的表达率为4.8%,用内毒素(10 mg/L)处理12 h后,DR5表达率上调为37.76%。LO2细胞12 h凋亡率:内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组、内毒素联合mDRA-6组细胞凋亡率分别为37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(P<0.05)。细胞凋亡率与内毒素的剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性。结论:LPS对LO2细胞的杀伤作用主要通过诱导凋亡,细胞表面DR5受体的表达上调可促进这种凋亡作用。     

抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞凋亡的作用

目的：研究鼠抗人DR5单克隆抗体（mDRA-6）对白血病细胞U937的凋亡诱导作用。方法：光镜下观察mDRA。6作用后U937细胞的形态变化；流式细胞术检测15937细胞表面DR5表达率；MTT法检测mDRA-6对U937细胞生长的影响；AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳检测U937细胞DNA的片段化降解；JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果：mDRA-6作用U937细胞后呈现典型的细胞凋亡特征；MTT法检测显示mDRA-6作用U937细胞24小时死亡率为61．09％，并呈时间、浓度依赖性；流式细胞仪检测显示10mg/L的mDRA-6作用4小时，U937细胞凋亡率为79．12％；琼脂糖凝胶电泳显示DNA呈现明显梯状带型；mDRA-6作用U937细胞后线粒体膜电位明显下降。结论：mDRA-6能够诱导白血病U937细胞凋亡，是具有诱导细胞凋亡活性的功能性抗体。     

mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞的杀伤效应

目的：探讨mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞有无杀伤作用及二者有无协同效应。方法：常规培养Jurkat细胞，流式细胞术检测细胞表面DR5的表达率，MTT法检测细胞毒性作用，Hoechst33258染色观察Jurkat细胞核形态变化，流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果：①Jurkat细胞表面DR5的表达率为84.83%。②mDRA-6与尼美舒利均能杀伤Jurkat细胞，存在浓度依赖性。400μmol/L的尼美舒利作用细胞10小时，细胞凋亡率为11.51%；0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时，细胞凋亡率分别为3.67%和6.3%；③二者联合具有较好的协同促凋亡作用，400μmol/L的尼美舒利联合0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时，细胞凋亡率分别为50.38%和63.79%。结论：mDRA-6与尼美舒利均有杀伤Jurkat细胞的作用，二者具有较强的协同作用，杀伤作用是通过诱导凋亡实现的。     

抗DR5单抗增强顺铂诱导HeLa细胞凋亡作用的研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)主要通过死亡受体5(death recep- tor,DR5)诱导肿瘤细胞凋亡。本文旨在探讨顺铂对HeLa细胞表面DR5分子表达影响及抗DR5单抗mDRA-6对顺铂诱导HeLa细胞凋亡增强作用。用间接免疫荧光染色结合流式细胞术分析DR5分子表达;MTT法检测HeLa细胞毒作用;用AnnexinV/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率;荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果:正常HeLa细胞表面DR5表达量为30.01%,顺铂不能上调HeLa细胞表面DR5表达;mDRA-6可以明显提高顺铂对HeLa细胞的细胞毒作用,且存在剂量效应关系。IC_(50)值约为12.5μg/ml。研究结果表明,mDRA-6能够明显增强顺铂对HeLa细胞的细胞毒及细胞凋亡作用。     

抗人DR5单克隆抗体mDRA-6对HL-60细胞的诱导凋亡作用

目的 观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体nDRA-6对HL-60细胞的凋亡作用.方法 制备抗人DR5单克隆抗体mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用后HL-60细胞的形态变化;MTT法测定不同浓度mDRA-6在不同作用时间对HL-60细胞存活的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞仪检测mDRA-6对HL-60细胞凋亡率的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果 mDRA-6导致HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对HL-60细胞具有明显的杀伤作用,24ng/mL mDRA-6作用HL-60细胞10 h,细胞死亡率达21.2%;1μg/mL的mDRA-6作用8 h,可使HL-60细胞死亡44.1%;Annexin V及PI双染显示,10μg/mL mDRA-6作用2 h,HL-60细胞的凋亡率达48.1%;20μg/mLmDRA-6作用HL-60细胞3 h,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显的"梯形"条带.结论 抗DR5单克隆抗体mDRA-6具有诱导HL-60细胞凋亡作用.     

抗DR5单克隆抗体-mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用

目的:观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体(mAb)-mDRA-6对白血病细胞的凋亡作用。方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗人DR5mAb-mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用下白血病细胞Jurkat、HL-60、K562的形态变化;MTT法测定不同浓度的mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞存活率的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞术检测mDRA-6对Jurkat、HL-60、K562细胞凋亡率的影响。结果:mDRA-6导致Jurkat、HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对Jurkat、HL-60细胞具有明显的杀伤作用,但对K562的杀伤作用较弱,25mg/L的mDRA-6作用12h,Jurkat、HL-60、K562细胞死亡率分别为88.76%,59.76%,5.18%。Annexin V及PI双染显示1mg/L的mDRA-6作用10h,Jurkat细胞凋亡率为86.06%,10mg/L的mDRA-6作用10h,HL-60细胞凋亡率为48.11%,但10mg/L的mDRA-6作用K562细胞10h,细胞凋亡不明显。结论:抗DR5mAb mDRA-6能够诱导白血病细胞凋亡,不同的白血病细胞株对mDRA-6的敏感性不同。     

抗人DR5单抗致白血病U937细胞凋亡的作用机制

目的探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937凋亡诱导作用及机制。方法 MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测mDRA-6对U937细胞的生长抑制及凋亡诱导作用,Western blotting检测caspase8、10、3、9及Cytochome C在U937细胞凋亡过程中的表达及激活情况;选用caspase8、10、3抑制剂预处理U937细胞,观察是否抑制mDRA-6对U937细胞的凋亡诱导作用。结果MTT结果显示:10mg/L的mDRA-6作用U937细胞24h,细胞死亡率为61.09%,呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示mDRA-6作用4h,细胞凋亡率为69.03%;Western blotting结果显示caspase10、3、9及Cytochome C均有活性片断表达,而caspase8无明显激活;caspase10和caspase3抑制剂部分抑制mDRA-6的凋亡诱导作用,caspase8抑制剂作用不明显。结论抗人DR5单克隆抗体mDRA-6通过死亡受体和线粒体途径诱导白血病U937细胞凋亡。     

抗人DR5抗体mDRA- 6细胞毒作用机制分析

目的:探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mAb)mDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用及其机制。方法:以流式细胞术测定mAbmDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用和细胞凋亡作用,以及caspase8、9的抑制剂对mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡的影响。在荧光显微镜下,观察mAbmDRA-6对Jurkat细胞形态的影响。以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中的DNA片段化。结果:mAbmDRA-6对Jurkat细胞具有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。caspase8的抑制剂可明显抑制mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡,caspase9的抑制剂的影响很小。结论:mAbmDRA-6可通过死亡受体信号传导途径诱导Jurakt细胞凋亡,对Jurkat细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究

目的 研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体（McAb）。方法 以可溶性人死亡受体（death receptor，DR）5胞外段免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb；MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞；亲和层析方法纯化McAb；夹心ELISA法测定McAb亚型；Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型；间接ELISA法检测McAb的特异性；流式细胞仪检测FITC-annexinⅤ／PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化。结果 获得1株杂交瘤细胞，其分泌的McAb命名为mDRA-6，为IgG1；其抗原表位类型为构象表位；其特异性识别hDR5，与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用；经McAb mDRA-6处理后，Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂，并导致Jurkat细胞中的DNA片段化。结论 mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体，在以TRAIL／DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制。方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等凋亡相关蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势。免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等表达活性增加,并且Cytoc在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象。结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡。本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础。