实体肿瘤组织石蜡切片的免疫组化实验方法总结

<正>0引言免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究~([1])。作者所在实验室,有丰富的实体肿瘤组织(特别是食管癌组织)石蜡切片免疫组化的实验经验。结合现有的相关文献~([2-4]),现将实体肿瘤组织(特别是食管癌组织)石蜡切片免疫组化所需试剂、耗材、设备和具体实     

自然衰老C57BL/6J雄性小鼠肝脏的定量与乙酰化修饰蛋白质组学特征

目的 获取自然衰老C57BL/6J雄性小鼠肝脏的蛋白质组学与乙酰化修饰蛋白质组学特征。方法 采用串联质谱标签标记定量与液相色谱-串联质谱联用技术,获取生理状况下2月龄与18月龄C57BL/6J雄性小鼠肝脏的蛋白质组学与乙酰化修饰蛋白质组学数据,开展生物信息学分析。结果 蛋白质组学共定量4712个蛋白质,其中,年轻、年老小鼠中有195个差异表达蛋白质;乙酰化修饰蛋白质组学共定量4818个位点,对应1367个蛋白质,其中,年轻、年老小鼠中有113个表达位点有差异,对应76个蛋白质。衰老相关的上调蛋白质主要与脂肪酸代谢、环氧合酶P450途径、药物分解代谢、有机羟基化合物代谢、花生四烯酸代谢等生物学过程相关,下调蛋白质主要与基因沉默、核小体组装、蛋白质异源四聚、干扰素反应、蛋白质-DNA复合物组装等生物学过程相关。伴随衰老上调的乙酰化修饰位点所在蛋白质主要与辅因子代谢、小分子分解代谢、磷酸核糖代谢、核糖核苷酸代谢、嘌呤代谢等生物学过程相关,含下调乙酰化位点的蛋白质主要与含硫化合物代谢、未折叠蛋白反应、氨基酸代谢等生物学过程相关。结论 本研究客观展示了自然衰老C57BL/6J雄性小鼠肝脏的定量和乙酰化修饰蛋白质组学特征,为衰老相关机制探索和干预研究提供了可资参考的数据集。     

质谱技术在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域,它通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究,来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理[1].蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Expression Proteomics)和细胞图谱蛋白质组学(Cell Map Proteomics),前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量图谱,它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析,它能在整体蛋白质水平上研究细胞的通路,以及疾病、药物和其它生物刺激所引起的紊乱,因此它可能发现疾病标志和阐明生物通路;后者是指通过纯化细胞器或蛋白质复合物,用质谱鉴定蛋白质组分,确定蛋白质和蛋白质相互作用的亚细胞位置[2].90年代以来随着人类基因组计划的实施,引发了生物信息学(Bioinformatics)的发展,使蛋白质分析发生了革命性的变化.现在将高分辨2-维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长的蛋白质和DNA数据库三者结合起来,为高通量的蛋白质组学(High throughout Proteomics)铺平了道路[3].这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用.     

COLD-PCR/Sanger测序体系检测HBV耐药基因型突变的临床应用评价

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因突变是导致病毒耐药的基础~([1-3]),虽然测序技术已广泛应用于HBV耐药突变检测~([4]),但其较低的灵敏度大大限制了其临床应用价值~([5-6]);反向杂交的灵敏度较高,约为5%,但其价格较贵,操作不够简便,尤其在发展中国家无法全面推广;一些新的技术,如质谱分析、超深度测序和高通量测序~([7])等技术逐渐得以应用,但是这些技术存在价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作量大、存在碱基错配等缺点,较适合于研究目的,不太适合于临床应用。为了克服以上方法的缺点,建立高灵敏度、简便、价廉和实用的HBV耐药突变检测方法,本研究建立了低变性温度共扩增PCR(coamplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction,COLD-PCR)法~([8-9])并联合Sanger测序技术,将其应用于HBV已知和未知的耐药突变检测。     

常规西药联合血必净治疗重症肺炎疗效的Meta分析

正重症肺炎属肺炎的特殊类型,其病理改变主要为肺部组织炎症性疾病,且病变范围较大,临床表现可见呼吸困难、意识模糊、心率加快,并发全身组织器官损伤~([1])。脓毒血症和器官衰竭是重症肺炎死亡的主要原因,抗感染、干预炎症是主要的治疗手段~([2])。但近年来因为抗生素不合理利用,病原体不断变迁~([3]),病原菌不断出现耐药性~([4]),且病后感染会造成治疗失控~([2]),使治疗难度进一步增加。血必净作为一种有解毒、去除炎症介质等功效的中药注射剂,目前有不少临床试验已证实其能有效治疗重症肺炎~([5-7]),     

无标记定量方法在小鼠精子发生相关蛋白质组学研究中的应用

目的: 利用无标记定量蛋白质组学技术筛选在3周龄及成年小鼠睾丸中差异表达的蛋白质?方法:分别抽提3周龄及成年小鼠睾丸蛋白,酶解后所得肽段经纳升液相色谱分离,并经LTQ Obitrap质谱鉴定,在获得蛋白鉴定信息的同时根据相应肽段离子质谱峰强度对蛋白进行相对定量?结果:在3周龄及成年小鼠睾丸中共鉴定到非冗余蛋白319种,其中30种蛋白在两者之间存在显著的表达差异,这些蛋白主要参与形态发生?收缩?胞吞?受精等细胞事件,与精子变形过程及精子功能相关?结论:无标记定量蛋白质组学技术,具有方法简便?通量大?成本低廉等优点,利用其寻找睾丸发育,精子发生/功能相关蛋白具有广阔的前景?     

舌下神经刺激治疗阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的研究进展

<正>阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)是一种常见的慢性睡眠呼吸障碍性疾病,研究已证实OSAHS是高血压~([1-2])、脑卒中~([3-4])、胰岛素抵抗~([5])、心肌梗死~([6])、猝死~([7])等疾病的危险因素。OSAHS在普通人群中的患病率为3%～7%~([8]),由于肥胖和人口老龄化,其患病率正逐步增加。目前OSAHS主要治疗方法包括持续无创气道正压(continuous positive airway pressure,CPAP)通气、口腔矫正器及手术治疗,其中CPAP是中重度OSAHS患者首选治疗方法,然而其不易被接受、依从性不高~([9])。探索一种易被接     

人类巨细胞病毒感染的特异性血清蛋白差异表达

目的应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术,筛选在人类巨细胞病毒(HCMV)血清差异表达蛋白。方法收集HCMV感染者与正常人的血清各10例,去除高丰度蛋白,iTRAQ试剂标记后采用液相色谱-串联质谱技术鉴定特异性蛋白,并比较蛋白的表达差异。结果共鉴定出362种蛋白质。对比发现有49种血清蛋白的表达差异超过两倍,其中蛋白表达显著上调的有19种,显著下调的有30种;这些差异蛋白中有6种与HCMV感染具有较高的相关性,分别是:脂联素、α-1抗胰蛋白酶、载脂蛋白E、C反应蛋白、结合珠蛋白和血清淀粉样蛋白A1。结论定量的血清蛋白质组学分析,可有效地获得HCMV感染者与正常人的血清蛋白质组差异表达图谱,筛选出与HCMV感染相关的特异性蛋白,为HCMV的早期诊断与治疗提供依据。     

自然分娩初产妇产后盆底功能障碍性疾病临床相关因素研究

正盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)是由于盆底结构和功能异常所引起的一系列疾病的总称,主要表现为压力性尿失禁和盆腔脏器脱垂~([1])。三维经会阴盆底超声目前已成为诊断PFD的可靠手段~([2-3])。研究发现,妊娠和分娩是PFD独立的危险因素~([4-5]),尤其是第一次妊娠和分娩~([6-7])。相关文献显示,自然分娩的孕产妇PFD发生率高于剖宫产~([8-10]),其原因尚不清楚。本研究分析经自然分娩的初产妇发生PFD的高危因素,报道如下。     

中药调理HIV感染患者的免疫缺陷

艾滋病(AIDS)是一种20世纪80年代初发现的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的传染病~([1-3]),2016年全球有3670万HIV感染者~([4]),联合国艾滋病规划署(United Nations Program on HIV/AIDS,UNAIDS)称HIV/AIDS已然是影响全世界健康、经济发展和社会安定的最巨大的危机之一~([5])。自从1996年c ART出现,AIDS病死亡率和发病率显著下降~([6,7]),提升了患者生活质量和生存率,改善了健康状况,抑制了疾病发展和进展。目前为止,cART是AIDS病最为有效的治疗方式。然而c ART有明显的不良反应,主要包括骨髓抑制、疲乏、皮肤病变、肝损伤、肾损伤、消化道不适(包括腹泻、腹胀、腹痛、呕吐)、过敏反应、血脂异常以及睡眠障碍等。cART长期用药通常被药物毒性、低顺从性以及耐药性所限制[8]。所以使用HAART的HIV患者的生活质量必定会不如正常未感染者,特别是感染后属于晚期诊治阶段的患者。补充和替代疗法(CAM)已经被广泛用来治疗AIDS和它的并发症,治疗方式包括中药(TCM)、针灸、艾灸以及气功。TCM作为补充和替代治疗(CAM)应用于临床,极大地提高了HIV/AIDS患者免疫力并减轻了副作用,相关临床研究已经证明了TCM在治疗AIDS中的巨大作用。CD4+T细胞量和HIV量是WHO治疗AIDS推荐的金标准,CD4+T细胞数量和HIV病毒量测定已公认为评估和检测cART疗效推荐的方法~([9]),在过去三十年里相关研究显示TCM作为一种替代药物能部分降低血浆中HIV病毒载量~([10]),增加CD4+T-cell数量~([11]),促进免疫重建~([12]),缓解症状和体征~([13]),并缓解ART的副作用[14-18],提升患者健康相关生活质量~([19])。     

定量蛋白质组学检测技术进展

目前蛋白质组学的研究主要集中在不同细胞或组织表达的全部蛋白质在数据库的构建与细胞在不同状态下表达差异的研究上[1].随着比较蛋白质组学的发展,定量技术成为人们关注的热点.因此有人提出"定量蛋白质组学(quantitative proteomics)"的概念.定量蛋白质组学就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科[1].这一概念的提出标志着有关蛋白质的许多研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展.     

有Jaccoud关节病表现的银屑病性关节炎个案报告及文献复习

Jaccoud关节病首先在1896年由Bywaters在风湿热患者中描述~([1]),是一种具有特征性的多发性关节半脱位畸形而功能保持良好的非侵蚀性关节病,受累关节多为手、足小关节~([2]),踝、膝、肘、肩等大关节少见~([3-4]).     

蛋白质组学在消化系统肿瘤中的研究进展

随着蛋白质组学相关技术的迅速发展，蛋白质组学已成为当今细胞生物学领域中极其活跃的学科。蛋白质组学的核心技术包括双相电泳、质谱分析、蛋白质组信息学。蛋白质组学从新的角度研究肿瘤，寻找肿瘤标记蛋白，进而阐明其表达水平的变化与肿瘤发生、发展不同阶段的相互关系，对肿瘤的早期诊断具有重要意义。作者就蛋白质组学研究相关技术、策略及其在消化系统肿瘤中的应用作简要综述。     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

线粒体差异蛋白质组学在神经系统疾病中的研究进展

近年来,蛋白质组学的发展为系统性、整体性的分析线粒体蛋白质组提供了可能性,现将蛋白质组学技术在神经系统中的研究做一综述。线粒体蛋白质的分离鉴定传统的基于凝胶电泳的蛋白质鉴定技术:如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)结合质谱技术。近几年来,2DE技术有了很大发展。差异凝胶电泳(DIGE)是2DE的发展,DIGE技术最早在1997年由Jon Minden实验室提出,其技术路线是将样品在电泳前标记Cy2、Cy3和Cy5这3种荧光染料(其中Cy2作为用Cy3、Cy5标记的蛋白质内标,用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异),然后将标记后的3种样品混合,同时在一块胶上进行电泳。该方法的灵敏度高,可     

慢性阻塞性肺疾病并发侵袭性肺曲霉病诊治策略

<正>侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)是一种严重肺部感染性疾病,以机会性致病菌曲霉侵袭气道、肺组织或血管,致组织炎症及坏死为特点~([1-2])。早先认为IPA主要发生在严重免疫缺陷宿主,如粒细胞缺乏、骨髓移植、器官移植及获得性免疫缺陷等~([3])。近期研究发现慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)也是发生IPA的危险因素,报道病例数越来越多且病死率高~([1, 4-5]),有文献报道慢阻肺合并IPA死亡率高达50%以上~([6]),其原因多为诊断及治疗的延迟~([5, 7])。现将慢阻肺合并IPA的发病机制、临床特点、实验室检查方法和诊治进展做一综述。     

抗磷脂综合症发病机制与临床诊治的进展

正抗磷脂综合症(antiphospholipid syndrome,APS)是一种由抗磷脂结合蛋白自身抗体引起的自身免疫性疾病,临床特点为反复静脉或动脉血栓,和/或习惯性流产或死胎。1999年国际APS工作组在日本札幌(Sapporo)制定了APS诊治标准~([1]),并在2006年ISTH会议上做了修订~([2]),我刊亦做了全面介绍~([3]),以后国际上又相继提出了多个有关的指南,这些已成为国内外     

气候因素在皮下特异性免疫治疗致全身不良反应中的影响

正特异性免疫治疗是世界过敏组织认证的唯一有效干预过敏进程的一种治疗方式~([1])。其中皮下免疫治疗(subcutaneous immunotherapy,SCIT)就是一种安全、有效的治疗方法~([2-3]),但临床上发生局部和全身不良反应的风险依然存在~([4])。未控制的哮喘、小年龄儿童、维持剂量等均为特异性免疫治疗致全身不良反应的危险因素,更有较多研究提示尘螨生长和繁殖适宜的季节不良反应发生率较高~([5])。     

磷酸化蛋白质组学研究技术进展

翻译后蛋白质的修饰是目前蛋白质组学研究中的一个重要课题,蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法。