高脂饮食诱导的肥胖对小鼠精子线粒体及活动力损伤的机制研究

目的探究高脂饮食诱导的肥胖引起C57BL/6小鼠精子线粒体损伤及活动力低下的作用机制。方法构建肥胖实验动物模型。采用计算机辅助精液分析仪(computer-assisted semen analysis, CASA)分析其生育力相关参数,包括精子活动力、前向运动精子百分数以及精子浓度;运用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)分析正常与肥胖小鼠的睾丸形态学结构,荧光探针JC-1和罗丹明123对小鼠精子线粒体进行染色,采用流式细胞仪分析两组精子染色后的平均荧光强度,最后使用Real-time PCR对两组小鼠精子线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)的拷贝数进行分析。结果与正常野生型小鼠相比,肥胖小鼠的精子活动力、前向运动精子百分数明显减弱且睾丸形态存在异常,而精子浓度没有明显变化。进一步研究发现,与正常小鼠相比,肥胖小鼠的精子线粒体膜电位显著降低,但两者mt DNA拷贝数没有明显差异。结论肥胖能够引起精子线粒体功能损伤从而导致精子活动力及前向运动精子百分数低下,最终损伤雄性的生殖功能。     

精子线粒体DNA与男性不育研究进展

精子线粒体DNA(mtDNA)与男性生育能力关系密切。mtDNA是裸露的DNA,缺少组蛋白和DNA结合蛋白的保护,易受活性氧(ROS)的攻击,造成氧化损伤,且mtDNA缺少有效的修复系统,ROS引起的精子mtDNA改变将破坏mtDNA编码蛋白的合成,影响线粒体的功能,这可能是男性不育重要遗传学因素。找到引起精子mtDNA损伤的原因及其与男性不育的关系是研究的重点。本文综述了精子mtDNA与男性不育关系的最新研究进展。     

JC-1单标法检测精索静脉曲张患者精子线粒体膜电位的研究

目的:检测精索静脉曲张患者精子线粒体膜电位并探讨其临床意义。方法:将67例精索静脉曲张患者分为VC1组(精索静脉曲张1度,n=26)、VC2组(精索静脉曲张2度,n=21)和VC3组(精索静脉曲张3度,n=20),以正常生育男性为正常对照组(n=29)。通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规分析。精液标本洗涤处理后用荧光染料JC-1染色后上流式细胞仪分析,检测精子线粒体膜电位(JC-1+%)。结果:VC1、VC2、VC3组精子线粒体膜电位[(56.29±16.32)%,P<0.05;(45.04±13.21)%,P<0.01;(31.63±12.91)%,P<0.01]均显著低于正常对照组[(76.21±13.96)%]。96例标本中,JC-1+%与(a+b)级精子百分率呈显著正相关(r=0.693,P=0.000)。结论:精索静脉曲张可引起精子线粒体膜电位降低,可能是导致男性不育的重要原因之一。     

石萆汤通过调节线粒体膜蛋白PHB保护线粒体膜电位增强精子功能的探究

目的通过对90例男性不育弱精子症患者及30例正常男性进行分组处理观察石萆汤治疗弱精子症的可能靶点,探究石萆汤治疗肾虚夹湿型弱精子症的分子生物学机制。方法选择2016年8月～2018年6月在福建中医药大学附属人民医院男科门诊就诊的男性不育弱精子症患者和生殖体检者共120例,其中30例正常组与30例弱精子症组患者暂时未接受治疗,60例治疗组患者给予石萆汤治疗16周。治疗前后采用Western blot检测患者精子线粒体膜蛋白PHB及JC-1流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果由Western blot结果,我们可以看到弱精子症组的患者精子线粒体膜蛋白PHB表达量明显低于正常组(P0.05);在给予石萆汤治疗16周后,治疗组患者精子线粒体膜蛋白PHB蛋白表达量显著高于弱精子症组(P0.05)。通过对3组患者精子JC-1染色后进行流式细胞仪检测发现弱精子症组患者精子线粒体膜电位(红色荧光散点)与正常组和治疗组相比偏向下移,提示弱精子组患者精子症线粒体膜电位降低。而经过石萆汤治疗16周后流式红色荧光散点上移差异具有统计学意义(P0.05)。结论石萆汤治疗肾虚夹湿型弱精子症可能是通过调控精子线粒体膜蛋白PHB表达进而改变精子线粒体膜电位,最终提高精子活力,增强精子功能,值得在今后临床中应用,同时线粒体膜蛋白PHB可对精子功能进行衡量,可在今后的临床检验中进行检测反映精子功能与状态。     

精子线粒体功能障碍在弱精子症中的研究进展

世界范围内大约有15%的夫妇受不育症困扰,其中男性不育者的精液异常多表现为精子活力低下。研究表明,精子中线粒体膜电位、活性氧、线粒体内Ca2+含量、线粒体酶以及蛋白组活性、线粒体超微结构、mtDNA等的异常可引起精子活力下降。本文通过回顾线粒体与弱精子症的相关文献,阐述精子线粒体功能障碍在弱精子症中可能的作用,为弱精子症发生发展机制的研究提供新的思路。     

龟龄集胶囊对弱精子症精子线粒体功能的作用机制研究

目的观察龟龄集胶囊对特发性弱精子症精子线粒体的作用,探讨龟龄集胶囊治疗特发性弱精子症的机制。方法根据特发性弱精子症诊断标准,筛选特发性弱精子症且中医辨证属肾阳虚的患者253例为治疗组,根据前向运动(A级+B级)精子的百分率分成3组:35%≤A组500/0、20%≤B组35%、C组20%;选取61名正常生育男性为空白对照组。A、B、c组均用龟龄集胶囊治疗,每次0.6 g,每日2次,4个月为一个疗程。对各组精子治疗前后均作精子线粒体功能检测和精液分析,并观察各组精子密度、精子活力、精子线粒体琥珀酸脱氢酶(SDt{)、线粒体膜电位(MMP)治疗前后的变化。结果 (1)各组治疗后线粒体功能SDH、MMP玫善,差异均有统计学意义(P0.01)。(2)各组前向运动精子活力均有明显提高(P0.01)。结论龟龄集胶囊能有效改善特发性弱精子症精子活力,其机制是改善精子线粒体琥珀酸脱氢酶和线粒体膜电位,从而提高了线粒体的功能。     

人精子体外氧化损伤对线粒体tRNA~(LeuUUR)基因的影响

目的:探讨活性氧(ROS)对人类精子线粒体tRNALeuUUR基因的氧化损伤。方法:采用Percoll梯度离心法筛选具有正常生理功能的精子,作为正常精子模型,并分为损伤组20例和对照组20例,分别加入次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系或不予处理,37℃有氧环境中孵育60min。分别提取精子DNA,以Fpg酶切损伤碱基并采用接头介导PCR(LM-PCR)检测线粒体tRNALeuUUR基因的氧化损伤。采用Rhodamine(Rh123)荧光探针标记精子,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位,观察精子的功能。结果:与对照组相比,损伤组精子孵育后线粒体膜电位明显降低[(116.27±11.72)%vs(64.00±4.88)%,P<0.05]。Fpg酶切和LM-PCR显示精子线粒体tRNALeuUUR基因损伤。结论:ROS可能通过对精子线粒体tRNALeuUUR基因氧化损伤而影响精子功能(线粒体膜电位明显降低),从而引起不育。     

肥胖导致男性不育的表观遗传机制研究进展

肥胖引发表观遗传改变可导致男性出现不育表型。关于肥胖与男性不育的关系问题,早期研究多集中于内分泌方面。近年研究发现肥胖还可以引发机体表观遗传改变,如DNA甲基化,残余组蛋白修饰,小RNA等,影响精子成熟发育。DNA甲基化是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸的胞嘧啶残基上的调节标记,肥胖导致DNA甲基化异常,并改变mRNA表达丰度,还可以影响印记基因表达出现印记基因病。残余组蛋白修饰方式包括甲基化、乙酰化等,它们可以相互作用或协同作用,以保证精子正常生长发育。肥胖可以改变甲基化酶及乙酰化酶活性,直接影响残余组蛋白的甲基化和乙酰化;还可以影响精子小RNA的表达,导致精子缺陷。本文就肥胖引起的表观遗传学改变及导致男性不育的作用机制做逐一综述。     

精子DNA完整性与精子形态的相关性研究

精子形态与其功能密切相关,任何形态上的缺陷都可能导致其功能下降,引起男性不育。已有研究证实,常规检查精液参数正常的男性不育患者可能存在精子DNA异常。精子DNA损伤可能影响辅助生殖技术（ART）的结局,增加复发性自然流产的发生率及卵胞浆内单精子注射（ICSI）后代的遗传风险等相关风险。因此精子DNA完整性检测不仅有助于探索不育的病因,而且有望成为ART治疗结局的重要评估手段.     

氧化应激检测在男性不育临床中的应用

活性氧 (ROS)在低浓度发生可以调节正常精子功能 ,而高浓度ROS危害精子的存活力和功能。ROS产生过量与抗氧化系统损伤会发生氧化应激 (OS)。目前认为损伤OS促进了一系列男性生殖功能的病理学改变。ROS介导的精子质膜过氧化损伤 ,可以解释在高比例的不育病人中观察到的精子功能缺陷。ROS产生过多也会破坏精子核内DNA的完整性。DNA碱基对OS敏感 ,这些结构的过氧化能引起碱基修饰、DNA链断裂以及染色质交联。由过量ROS诱发的DNA损伤会加速生殖细胞凋亡过程 ,导致与男性不育相关的精子计数降低 ,以及可以解释近半个世纪以来所观察到的精液质量明显下降现象。近 10年来 ,克里夫兰临床基金会的研究组已经查明了男性不育中OS的关键作用 ;研究的主要目的是将这些重要的知识从实验室转向临床应用。我们设计的研究目标 :①理解精液中OS发生的精确机制 ;②建立准确评估OS状态的实验 ,并进行质控研究 ;③检测OS与精子核DNA损伤之间的相关性 ;④鉴定精液OS评估对男性不育的临床意义     

褪黑素在活性氧致精子线粒体功能损伤中的保护作用

目的 :探讨活性氧 (ROS)对精子线粒体功能的损伤以及褪黑素 (MLT)的保护作用。　方法 :采用Percoll梯度离心法选择具有正常生理功能的精子 ,作为本实验的正常精子模型。应用次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系产生ROS ,在MLT存在与不存在情况下 ,与精子模型分别孵育 30和 6 0min后 ,采用酶组织化学方法分析精子线粒体部位的琥珀酸脱氢酶 (SDH)活性 ,采用Rhodamine 1 2 3(Rh1 2 3)荧光探针标记精子 ,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位。　结果 :正常精子与ROS孵育后 ,精子线粒体膜电位明显降低 ,线粒体SDH活力降低极为显著 ;而MLT则减轻了ROS对精子线粒体功能的损伤。　结论 :ROS可通过对精子线粒体膜电位和SDH活力的影响 ,而导致精子线粒体功能损伤 ;MLT可通过其有效的抗氧化能力 ,保护精子对抗ROS对其线粒体功能的损伤     

流式细胞术在精子功能检测中的应用

目的:研究流式细胞术在精子功能评价中的作用。方法:对104例男性不育患者和10例正常生育男性的精液标本进行精液量、精子密度、活动率、畸形率等精液常规分析(CASA法),对精子存活率、染色质结构和线粒体膜电位等进行流式细胞术分析,并将检测结果通过SAS软件进行统计学分析。结果:成组U检验结果表明:不育患者的精子与正常生育男性精子相比除了具有密度低(U=2.51,P=0.014 3)、活动率差(U=3.44,P=0.001)、畸形率高(U=-5.88,P<0.000 1)等特点外,经流式细胞术测定精子结果表明不育男性的精子质膜完整率(U=4.72,P<0.000 1)、线粒体膜电位正常率(U=-2.53,P=0.030 9)和染色质完整率(αt:U=-3.82,P=0.000 3;SDαt:U=-3.98,P=0.000 1;COMPαt:U=-3.57,P=0.000 5)均显著低于正常生育男性。多元逐步回归分析结果表明:精子质膜完整性与精子活动率(t=1.66,P=0.101 6)、精子的线粒体膜电位与精子活动率(t=3.33,P=0.001 4)、精子染色质的完整性与精子活动率(t=3.24,P=0.001 9)均呈正相关,而精子的线粒体膜电位与精子颈、尾部的畸形率呈负相关(t=-3.44,P=0.001)。结论:流式细胞仪测定对精子质量评定意义显著,对男性不育的诊断和治疗也具有较高的参考价值。     

益精方对特发性少弱精子症精子凋亡和线粒体功能影响的研究

目的:观察益精方对特发性少弱精子症精子凋亡和线粒体膜电位水平的影响。方法:采用自身前后对照的临床试验设计方法,观察益精方对30例特发性少弱精子症治疗前后精子凋亡率和线粒体膜电位的变化情况。结果:30例特发性少弱精子症患者精子早期凋亡率(AV+/PI-)治疗前为(4.26±2.79)%,治疗后为(2.86±1.47)%,线粒体膜电位(MMP)丧失率治疗前为(41.73±20.30)%,治疗后为(21.77±13.46)%,精子早期凋亡率和线粒体膜电位丧失率治疗前后比较有统计学差异(P<0.05);精子晚期凋亡和死亡率(PI+)治疗前为(34.10±16.26)%,治疗后为(30.21±13.50)%,治疗前后比较无统计学差异(P>0.05)。结论:益精方可以降低精子早期凋亡率,提高精子线粒体功能,这可能是益精方治疗少弱精子症的一个重要途径。     

精子DNA完整性和hOGG1 rs1052133与原发性男性不育的相关性研究

目的探讨人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase,hOGGl)基因rs1052133(Cys326Ser)及精子DNA完整性对原发性男性不育的影响。方法收集2011年8月至2012年12月间在宁夏医科大学总医院就诊的332例原发性男性不育患者和329例健康体检者分别作为病例组和对照组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测两组人群hOGGl rs1052133基因型;采用精子染色质扩散实验(SCD)检测病例组和对照组精子DNA损伤程度。分析精子DNA完整性与精液参数的相关性以及hOGGl rs1052133不同基因型与原发性男性不育的相关性以及对精子DNA完整性的影响。结果原发性男性不育患者精子DNA碎片指数(DFI)高于对照组;原发性男性不育患者精子DFI与前向运动精子和非前向运动精子呈负相关(r=-035和-0.13,P0.05),与不动精子呈正相关(r=0.24,P0.05);携带hOGGl rs1052133CC基因型的个体患原发性少弱精子症的风险是携带GG型个体的1.93倍。rs1052133与吸烟和饮酒与原发性男性不育的发病风险无交互作用,同时该位点三种不同基因型的患者间精子DFI差异无统计学意义。结论原发性男性不育患者精子DNA完整性降低,并且精子DNA损伤可导致精液质量下降,是原发性男性不育的病因之一。hOGGl rs1052133CC基因型可能是原发性男性不育的危险因素,但该位点可能不影响精子DNA完整性。     

精子DNA完整性分析在中医男科临床上的应用

男性不育为男科常见病之一,近年来呈不断上升的趋势.精予质量与男性的生育能力息息相关.人类精子DNA是遗传信息的载体,对后代的繁衍具有重要意义.精子的DNA包括核DNA (nuclear DNA,nDNA)和线粒体DNA (mitochondrial DNA,mtDNA),精子DNA完整性分析就是对精子的DNA受损伤后的碎片化与基因突变、异位、缺失改变等进行检测分析[1].随着精子DNA完整性分析在生殖医学领域的研究逐渐深入,建立了多种精子DNA完整性的检测方法,推进了该检测项目在临床上的应用.中医药在治疗男性不育方面有显著的疗效,但是中医药的诊断和治疗缺乏客观的、系统的实验室数据支持.因此为了人们对中医有一个深入的认识及将中医药的应用发扬光大,有必要将中医传统的宏观唯象辨证结合细胞、分子水平的研究以探索疾病、证候演变的实质,为临床治疗提供科学的理论依据.本文主要将精子DNA完整性与男性不育的关系以及精子DNA完整性在中医男科中的应用与潜在的诊疗价值作一综述和展望.     

精子DNA完整性损伤的发生机制及诊断治疗

正精子中DNA成分包括两个部分:位于精子头部的核DNA以及位于精子中部线粒体中的线粒体DNA(mtDNA)。精子核是重要的细胞器,在核DNA浓缩过程中,进行了局部重排,DNA结合蛋白的组型转换以及核小体结构丢失并最终形成高度浓缩的核DNA~([1])。一、精子NDA损伤的机制精子DNA是精子遗传信息的载体,精子DNA受损,可致精功能及受精能力下降。对于精子DNA损伤     

白藜芦醇对人精子冷冻损伤的保护作用

目的:通过在人精子冷冻保护液中添加白藜芦醇,研究其对冻融后精子质量和功能的影响。方法:选择正常精液与少弱精子症样本各50例,液化后的精液样本分别与甘油-卵黄-柠檬酸盐(GEYC)冷冻保护液或含有30μmol/L白藜芦醇的GEYC冷冻保护液混匀。冷冻复苏前后,进行精子活力、存活率及顶体反应分析。采用丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)检测试剂盒评估精子脂质过氧化程度及ROS水平。通过罗丹明123(Rh123)染色法及TUNEL试验检测精子线粒体膜电位及DNA损伤。结果:在正常精液和少弱精子症样本组中,与各组冷冻前新鲜精液相比,冻融后前向运动精子百分率、总活力、存活率、线粒体膜电位及顶体反应率均显著下降(P0.05),而精子ROS、MDA水平和DNA碎片指数(DFI)均显著升高(P0.05)。冷冻保护液中添加30μmol/L白藜芦醇后,正常精液组前向运动精子百分率[(43.1±6.3)%]、总活力[(56.9±7.4)%]、存活率[(67.5±5.6)%]、线粒体膜电位[(63.4±7.5)%]及顶体反应百分率[(26.3±4.7)%]较冷冻对照(未加白藜芦醇)的前向运动精子百分率[(32.7±4.8)%]、总活力[(44.8±6.9)%]、存活率[(52.3±6.1)%]、线粒体膜电位[(56.5±7.0)%]及顶体反应百分率[(16.6±3.8)%]均显著提高(P0.05),而精子ROS、MDA水平和DFI较冷冻对照均显著降低(P0.05)。在少弱精子症组中,添加白藜芦醇也均显著地提高了冷冻后精子前向运动百分率、总活力百分率、存活率、线粒体膜电位及顶体反应百分率,尤其是DFI[28.5±4.8)%]较冷冻对照[(36.3±5.7)%]显著降低(P0.01)。结论:在精液冷冻保护液中添加白藜芦醇可以通过降低精子内ROS水平减少精子冷冻损伤,从而改善解冻后精子质量和功能。     

精索静脉曲张所致不育的免疫学研究

目的研究精索静脉曲张(VC)所致不育与抗精子抗体(AsAb)的关系。方法240例男性不育患者分为VC组和对照组,行精液常规和AsAb检测。结果VC组AsAb阳性率为37.9%,对照组阳性率为25%,两组间有显著性差异(P<0.05);VC组中AsAb阳性率与临床分级密切相关(P<0.005),与精子密度亦明显相关(P<0.01)。结论免疫因素可能是导致VC不育的原因之一。     

淫羊藿苷对酒精致雄性小鼠生殖损伤的影响

目的探讨淫羊藿苷对酒精致雄性小鼠生殖损伤的保护作用,为临床治疗酒精致男性不育提供理论依据。方法成年雄性小鼠随机分为正常组(蒸馏水)、模型组(酒精组)和给药组(酒精+淫羊藿苷组),灌胃5周后处死并制备附睾精子悬液,分别测定精子密度、精子活动率、存活率、精子畸形率;JC-1染色法检测线粒体膜电位改变;制备睾丸组织切片,观察睾丸组织病理改变。结果模型组小鼠精子密度、精子活动率和存活率明显低于正常组,精子畸形率明显增加;给药组精子密度、精子活动率和存活率较模型组明显升高,精子畸形率明显降低。线粒体膜电位分析,模型组去极化细胞(凋亡细胞)比例明显高于正常组;给药组去极化细胞(凋亡细胞)比例低于模型组。睾丸组织切片观察发现,与正常组比较,模型组生精细胞层数减少,结构紊乱稀疏;给药组生精小管结构明显改善。结论淫羊藿苷对酒精致雄性小鼠生殖损伤有一定保护作用。     

辅酶Q_(10)的生物学功能及其对精子质量的影响

过氧化损伤是导致精子质量下降的重要原因之一,辅酶Q10是一种存在于线粒体中的脂溶性抗氧化剂,其在精浆和精子中的水平对男性生殖系统的抗氧化损伤能力具有重要影响。外源性补充辅酶Q10有利于改善精子质量,提高不育患者生育能力,对男性不育具有一定的辅助治疗作用。现就辅酶Q10的生物学功能及其对精子质量的影响,以及对男性不育的辅助治疗作用等方面作一综述。