人偏肺病毒感染住院儿童的临床特征及病毒基因特性分析

目的 了解急性呼吸道感染住院儿童中人偏肺病毒(hMPV)的感染情况、临床特征及人偏肺病毒基因特性.方法 对2006年2月至5月、2008年3月至4月及2008年9月至2009年2月收集的天津市儿童医院急性呼吸道感染住院儿童的310份鼻咽吸取物标本进行巢式PCR检测hMPV N基因片段,并对其中17株N基因片段进行序列测定,分析序列特征并绘制种系发生树.收集所有阳性患者的临床资料.同时采用多重PCR对N基因阳性标本进行其他常见呼吸道病毒的检测.结果 310份标本中共检出20份(6.5%)hMPV.hMPV阳性患儿的年龄中位数为15.0个月(16天～9岁),其中≤2岁患儿占90.0%(18/20).男性占60.0%(12/20).17株N基因种系发生树分析显示,11株为A2b亚型.20例hMPV阳性患儿的临床诊断均为支气管肺炎,占所有采集的肺炎患儿标本的7.1%(20/282),其临床症状以咳嗽、喘息、呼吸急促、发烧等常见.35%(7/20)需要重症监护,15%(3/20)需要吸氧治疗.平均住院时间为(11.9±4.8)d.A、B型间临床特征未见明显差别.hMPV无明显流行高峰.2例hMPV阳性患儿分别与腺病毒和鼻病毒混合感染.结论 hMPV可引起婴幼儿肺炎等严重疾病.天津地区流行的hMPV以A2b为优势流行型.     

北京新发现的人偏肺病毒N蛋白编码基因的序列分析

目的　了解新近从北京地区发现的人类偏肺病毒 (humanmetapneumovirus ,HMPV)N蛋白编码基因的特征。方法　从经RT PCR检测HMPV阳性的临床鼻咽洗液标本中进行HMPVN蛋白全基因扩增、克隆至pUCm T载体中并进行测序 ,与GenBank中的多株HMPVN蛋白基因序列进行比较和进化树分析。结果　经扩增并测序 ,标本BJ1816和BJ1887N蛋白基因全长为 1185bp ,编码 394个氨基酸。BJ1816N蛋白基因与国际上第一株HMPV分离株NDL0 0 1和GenBank中其它的多株HMPV的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .2 %～ 99.0 %和 96 .2 %～ 99.7%。BJ1887N蛋白基因与以上进行比较的各株HMPV的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .6 %～ 97.0 %和 96 .4 %～ 99.5 %。BJ1816和BJ1887之间N基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为 86 .6 %和 96 .4 %。提示BJ1816和BJ1887分属于HMPV的两个不同的基因进化簇。结论　从基因水平进一步证明新近发现的婴幼儿肺炎的新病原确为HMPV ,提示北京地区婴幼儿中同时存在两个不同进化簇 (即基因型 )的HMPV感染。     

2007—2011年长沙地区急性下呼吸道感染住院儿童人偏肺病毒的流行状况

目的了解人偏肺病毒（hMPV）在长沙地区急性下呼吸道感染住院患儿中的流行病学特点。方法收集2007年9月至2011年2月因急性下呼吸道感染在湖南省人民医院儿科医学中心住院儿童的鼻咽抽吸物（nasopharyngealaspirates,NPA）样本2613份,采用逆转录聚合酶链反应法（RT—PCR）检测hMPVM基因,将阳性PCR扩增产物测序并与GenBank中已知的hMPV参考株进行比对、分析。结果2613份标本中hMPV阳性检出数135例,检出率为5．2％,男女之间的检出率比较有统计学差异（x2=8．007,P=0．003）,hMPV阳性检出患儿的年龄以1岁以内多见（63．2％）。hMPV阳性检出率在春季呈现高峰,从检出季节分布显示A2b型主要在冬春季节流行,而B2型主要在春夏季流行。135例hMPV长沙株分为A型和B型两个主要的基因型,其中A2b亚型在2007--2008年为优势流行型别,2009--2010年A2b和B2型共同流行,B2亚型在2011年呈优势流行型别。135例hMPV检出阳性患儿中有66例（48．9％）存在混合病毒感染,其中与HBoV混合检出率最高。结论长沙地区部分儿童的急性下呼吸道感染与hMPV有关,且阳性检出患儿年龄主要集中在1岁以下,男多于女,主要流行季节在春季,A2b型和B2型优势基因型在长沙地区共同流行,与其他病毒混合检出率较高。     

马传染性贫血病毒囊膜蛋白GP90的表达及其免疫效果研究

目的：探索马传染性贫血病毒（EIAV）野毒株（强毒，LN）和疫苗毒株（弱毒，DLV）的囊膜蛋白GP90作为鉴别诊断试剂的效果及基因工程疫苗的可能性。方法：将中国EIAV疫苗株（DLV）及其亲本毒株辽毒株（LN）接种于驴外周血白细胞培养物，提取前病毒DNA，并以其为模板，经聚合酶链法（PCR）扩增出LN和DLV的GP90片段，在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达。表达的GP90蛋白经金属离子亲和层析（IMAC）纯化后免疫小鼠，ELISA法检测抗EIAV抗体，中和试验检测中和抗体活性。同时对DLV和LN GP90的核苷酸与氨基酸进行比较。结果：DLV和LN GP90核苷酸序列的同源性为95．3％，氨基酸序列的同源性为87.7％。未加佐剂组抗体滴度为800，佐剂组抗体滴度达1600;不加佐剂组的中和抗体滴度在40－80之间，加佐剂组中和抗体滴度在80－160之间。结论：成功构建了分别表达EIAV野毒株LN和疫苗毒株DLV囊膜蛋白GP90的重组杆状病毒，大量表达的蛋白纯化后纯度较好，该纯化产物在小鼠体内可激发良好的体液免疫应答。     

南京地区儿童人偏肺病毒感染的流行病学及临床特征分析

目的了解南京地区儿童人偏肺病毒（hMPV）感染的流行病学特点及临床特征。方法收集2009年8月至2010年7月南京医科大学附属南京儿童医院住院及门诊呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物（NPA）及咽拭子（NPS）共642例,采用逆转录聚合酶链反应法（RT—PCR）检测hMPVM基因,将阳性PCR扩增产物进行测序、同源性和进化分析。结果642例标本中共检出hMPV阳性扩增产物35份,检出率为5．5％。系统进化分析显示南京地区hMPVB1型占51．4％,A2b型占31．4％。hMPV的发病高峰在4月份。其致呼吸道感染以1岁以内多见（71．4％）。35例hMPV感染患儿中有15例（42．8％）存在混合感染,其中与HRV的混合感染检出率最高。临床诊断以肺炎（17例,48．6％）最为常见。结论人偏肺病毒是南京地区儿童急性呼吸道感染的重要病原之一,该年度其优势流行型别为B1型,南京地区A、B两型hMPV感染患儿临床特征无明显差异。     

人偏肺病毒病原学与防治研究进展

人偏肺病毒（human metapneumovirus,HMPV）是2001年由荷兰学者vanden Hoogen等[1]首次从儿童呼吸道感染标本中分离发现的.研究发现其在世界范围内均有流行,可引起呼吸道感染,尤其在儿童、患有基础疾病的成人、老年人、免疫功能不全或器官移植患者可引起重症呼吸道感染.目前针对HMPV尚没有特异的抗病毒药物及安全有效的疫苗.本文就目前该病毒的病毒学特征、实验室诊断、治疗及疫苗研制的研究现状进行综述.     

北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒（hMPV）编码基因的特征。方法在原先工作的基础上，从分属于hMPV的两个不同基因进化簇（即基因型）的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因，克隆至pBS-T载体中并进行测序，与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析。结果BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸，编码539个氨基酸。BJ1816和BJ1887F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83．8％和94．4％，与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性（98．3％～99．6％）。BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白，具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点（RQSR）。BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性（96．9％vs93．8％）；除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外，F1亚单位的其余部分较保守（95．4％）；糖基化位点保守。种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇。结论F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型，其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似，是病毒的膜表面糖蛋白，提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用。     

2a型HCV E1、E2/NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）2a型基因组E1 E2／NS1区序列，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能奠定基础。方法：用逆转录套式PCR（RT－nPCR)从江苏省1例丙型肝炎患者血清中扩增出两条分别约770bp、1100bp的片段，分别以限制性内切酶EcoR I、BamH I和EcoR I、Hand Ⅲ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性酶切长度多态性分析（RFLP）和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果：分别测得约770bp、1100bp的核苷酸序列，拼接后得到的完整核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV－1、HC－C2、HCV－BK、HC－J6、HC－J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为60．5％、60．1％、59．7％、87．8％、67．5％；在氨基酸水平上的同源性分别为67．3％、66．4％、65．0％、87．8％、79．0％。结论：分离株（HCV－JS）与HC－J6同属2a型，但同源性有一定差异。     

北京地区人偏肺病毒核蛋白基因的原核表达及抗原活性分析

目的用大肠杆菌表达获得人偏肺病毒主要结构蛋白N蛋白，为下一步的深入研究奠定基础。方法从重组质粒pUCm-N1816中PCR扩增获得N基因，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入到原核表达载体pET30a（＋）中，得到重组表达质粒pE130a-N1816，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPIG诱导培养。SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。结果经双酶切和测序证明1．2kb N1816。基因正确插入pET30a中，并具有正确的读码框架，得到预期的pET30a-N1816重组原核表达质粒。37℃，1mmol／L IFIG诱导培养6h后产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白，主要以包涵体形式存在，占细胞总蛋白的20％左右。N蛋白粗提物经Co^2＋亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示，体外所表达的蛋白能和特异性抗血清及人血清反应。结论本研究成功构建了重组pET30a-N1816原核表达质粒，N蛋白获得了高效表达，并且具有特异抗原活性，可用于人偏肺病毒的深入研究。     

人偏肺病毒广州分离株全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的偏肺病毒基因组分子结构特点和基因型类型.方法 参考GenBank上的偏肺病毒00-1株(AF371337)基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增偏肺病毒基因组,克隆于T载体上,序列测定,用Clustal W/X、DNASTAR、MEGA4.1等软件分析基因组序列.结果 偏肺病毒hMPVgz01全基因组为13 327 bp,提交到GenBank上的序列号为GQ153651,有8个开放阅读框(open reading frames,ORFs),基因组结构为:3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5;将hMPVgz01株全基因组核苷酸序列与GenBank上的偏肺病毒全基因组序列进行Clustal W比较,发现与偏肺病毒的A组相似性较高,为92%～97%,与A2b组的BJ1887相似性为最高,而与B组相似性为81%,与C组的禽偏肺病毒为71%.将hMPVgz01株的N、F、G基因与偏肺病毒的A1、A2、B1、B2的相对应基因进行相似性比较,同样也是与A2b型的相似性为最高,因此确认广州地区的hMPVgz01株为A2b型.结论 广州地区儿童感染的偏肺病毒hMPVgz01株全基因组序列为13 327 bp,GenBank 序列号为GQ153651,hMPVgz01与偏肺病毒的A2b型相似性最高,确认hMPVgz01株属于偏肺病毒A2b型.     

人偏肺病毒研究进展

<正>人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是新近发现的一种呼吸道致病病毒,2001年首次在荷兰一婴儿的鼻咽部抽吸物中被分离得到,根据它的形态学、生物化学以及基因学特点,hMPV一开始被分类为禽偏肺病毒,禽偏     

云南省陇川县HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定和分析

使用ＰＣＲ对２１份采集于１９９５年中的云南陇川县ＨＩＶ－１阳性静脉吸毒者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增，从１７份样品中获得了ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段，并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。研究结果表明，１７份陇川样品中存在Ｂ和Ｃ两种亚型的ＨＩＶ－１毒株序列，各亚型内的基因离散率分别为４．７％和３．３％。与Ａ～Ｅ参考亚型及部分Ｂ和Ｃ亚型代表株序列相比较，属陇川Ｂ亚型的１４个毒株与包括泰国、缅甸及云南瑞丽在内的Ｂ亚型毒株序列十分接近，基因离散率在３．９％～４．５％的范围内；属陇川Ｃ亚型的３个毒株则与代表印度毒株的Ｃ亚型共享序列及瑞丽Ｃ亚型毒株序列十分相似，其基因离散率均为２．５％。以上数据提示，ＨＩＶ－１在陇川的流行时间不长，且Ｂ和Ｃ亚型毒株的传入时间相差１年左右。对Ｂ亚型毒株Ｖ３环序列的分析还发现，位于Ｖ３环顶端的四肽序列中ＧＰＧＱ占６４．３％，ＧＰＧＲ则仅占２８．６％，且编码其精氨酸（Ｒ）的密码子均为ＣＧＡ而不是ＡＧＡ。此结果与作者根据早期瑞丽ＨＩＶ－１毒株序列研究结果得出的推测相吻合。     

儿童急性呼吸道博卡病毒感染的病毒载量与临床特征相关性研究

目的 研究急性呼吸道感染患儿人博卡病毒（ human bocavirus,H BoY）病毒载量与临床特征的相关性。方法 对2009年l1月至2010年12月间956例呼吸道感染的患儿及251例健康对照组儿童鼻咽部抽吸物、咽拭子采用PCR法进行HBoV检测,进而对阳性样本进行实时荧光定量PCR法测定博卡病毒DNA载量,并结合患儿的临床检查进行综合分析。结果 实验组与对照组HBoV阳性率存在显著差异,下呼吸道感染病例HBoV的病毒载量水平与上呼吸道感染病例及对照组儿童差异均有统计学意义,上呼吸道感染病例与对照组儿童病毒载量无统计学意义,重症下呼吸道感染患儿与普通下呼吸道感染患儿HBoV的病毒载量无统计学差异,HBoV混合感染与独立感染患儿病毒载量亦无统计学差异。结论 博卡病毒常年均可引起发病,是儿童呼吸道感染的重要病原体之一,但可能不是儿童急性呼吸道感染的唯一因素。HBoV病毒载量并不能独立反映临床疾病感染的严重程度。     

Co-circulation of genetically distinct human metapneumovirus and human bocavirus strains in young children with respiratory tract infections in Italy

The discovery of human Metapneumovirus (hMPV) and human Bocavirus (hBoV) identified the etiological causes of several cases of acute respiratory tract infections in children. This report describes the molecular epidemiology of hMPV and hBoV infections observed following viral surveillance of children hospitalized for acute respiratory tract infections in Milan, Italy. Pharyngeal swabs were collected from 240 children ≤3 years of age (130 males, 110 females; median age, 5.0 months; IQR, 2.0-12.5 months) and tested for respiratory viruses, including hMPV and hBoV, by molecular methods. hMPV-RNA and hBoV-DNA positive samples were characterized molecularly and a phylogenetical analysis was performed. PCR analysis identified 131/240 (54.6%) samples positive for at least one virus. The frequency of hMPV and hBoV infections was similar (8.3% and 12.1%, respectively). Both infections were associated with lower respiratory tract infections: hMPV was present as a single infectious agent in 7.2% of children with bronchiolitis, hBoV was associated with 18.5% of pediatric pneumonias and identified frequently as a single etiological agent. Genetically distinct hMPV and hBoV strains were identified in children examined with respiratory tract infections. Phylogenetic analysis showed an increased prevalence of hMPV genotype A (A2b sublineage) compared to genotype B (80% vs. 20%, respectively) and of the hBoV genotype St2 compared to genotype St1 (71.4% vs. 28.6%, respectively). Interestingly, a shift in hMPV infections resulting from A2 strains has been observed in recent years. In addition, the occurrence of recombination events between two hBoV strains with a breakpoint located in the VP1/VP2 region was identified.     

Prevalence and seasonality of six respiratory viruses during five consecutive epidemic seasons in Belgium

BackgroundAcute Respiratory Infections (ARIs) are a major health problem, especially in young children and the elderly.ObjectivesInsights into the seasonality of respiratory viruses can help us understand when the burden on society is highest and which age groups are most vulnerable.Study designWe monitored six respiratory viruses during five consecutive seasons (2011–2016) in Belgium. Patient specimens (n = 22876), tested for one or more of the following respiratory viruses, were included in this analysis: Influenza viruses (IAV & IBV), Human respiratory syncytial virus (hRSV), Human metapneumovirus (hMPV), Adenovirus (ADV) and Human parainfluenza virus (hPIV). Data were analysed for four age categories: <6y, 6–17y, 18–64y and ≥65y.ResultsChildren <6y had the highest infection rates (39% positive vs. 20% positive adults) and the highest frequency of co-infections. hRSV (28%) and IAV (32%) caused the most common respiratory viral infections and followed, like hMPV, a seasonal pattern with winter peaks. hRSV followed an annual pattern with two peaks: first in young children and ±7 weeks later in elderly. This phenomenon has not been described in literature so far. hPIV and ADV occurred throughout the year with higher rates in winter.ConclusionsChildren <6y are most vulnerable for respiratory viral infections and have a higher risk for co-infections. hRSV and IAV are the most common respiratory infections with peaks during the winter season in Belgium.     

Seasonality and clinical features of human metapneumovirus infection in children in Northern Alberta

Human metapneumovirus (hMPV) causes respiratory tract infections in all age groups. The characteristics of pediatric hMPV infection in Northern Alberta have not been studied. The objectives of this study were to determine the seasonality of pediatric hMPV infections over a 13-month period, the genetic relationship of hMPV isolates to hMPV detected in other parts of Canada, and the burden of illness and possible risk factors for pediatric hMPV hospitalization. Detection of hMPV by polymerase chain reaction was performed on nasopharyngeal specimens collected from outpatients and inpatients at the Stollery Children's Hospital in Edmonton, Alberta, November 12, 2002-December 31, 2003. Forty-two of 1,079 specimens were positive for hMPV (3.9%) from 41 patients (14 outpatients and 27 inpatients), with a peak incidence during January-April, but isolates were detected 10 months of the year. Co-infection was not detected in 39 specimens from which RSV had been detected. Two hMPV genetic clusters were detected, and the isolates were homologous to those of previous Canadian isolates. Four of the 14 outpatients had reactive airways disease. Possible risk factors in the 27 inpatients included prematurity (n = 8), congenital heart disease (n = 6), gastroesophageal reflux disease or aspiration (n = 6), global developmental delay (n = 5), and multiple congenital anomalies (n = 4). Risk factors for hospitalization appear to be similar to risk factors for respiratory syncytial virus hospitalization.     

应用序列非依赖扩增技术检测儿童呼吸道标本中潜在病毒病原体

目的 应用序列非依赖扩增技术(sequence-independent amplification,SIA)检测常见病毒筛查阴性的5岁以下急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本中可能存在的潜在病毒病原体,了解SIA扩增文库中各种背景核酸的组成.方法 随机选择45份常见病毒筛查阴性的5岁以下急性呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物,0.45μm过滤和DNase/RNase处理去除病毒颗粒外的各种外源性核酸,再通过序列非依赖扩增技术对处理后的标本提取的核酸进行扩增,继而对扩增产物进行克隆、测序和BLAST比对.结果 测序403个克隆,获得有效序列368个,检出16个(16/368,4.3％)真核病毒同源序列,分别与Torque teno mini virus,Torque teno midi virus和Human bocavirus同源.此外,还检出1个真菌病毒( sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1)同源序列和5个细菌病毒(噬菌体)同源序列.其余检出序列包含206个( 206/368,56.0％)与人基因组DNA同源的序列,11个(11/368,3.0％) rRNA同源序列,72个(72/368,19.6％)细菌同源序列,4个(4/368,1.1％)真菌同源序列,5个(5/368,1.4％)寄生虫同源序列,6个(6/368,1.6％)食源性序列,以及36个(36/368,9.8％)未能确定分类的序列.结论 核酸消化结合SIA方法可以检出常规检测方法所无法检出的潜在病毒病原体,本研究为后续系统性的查找和监测未知病毒提供了基础.