Fibulin-1蛋白的真核表达与ELISA检测方法的建立

目的建立检测血清中Fibulin-1蛋白浓度的ELISA方法。方法构建Fibulin-1蛋白真核表达载体,以人Fibulin-1基因编码序列为模板,将目的片段定向克隆入载体并转入毕赤酵母菌,进行Fibulin-1蛋白的真核表达。表达产物纯化后,Westernblotting检测证明纯化的重组蛋白的抗原特异性。以该蛋白为定标绘制标准曲线,建立人血清ELISA检测方法并检测其精密度和回收率,最后初步分析人血清中Fibulin-1的含量。结果从真核表达体系获得了纯化的Fibulin-1蛋白,其具有良好的抗原特异性;建立的ELISA方法线性相关系数W=0．98,线性范围为12．5—800ng／mL,检测灵敏度为6．25ng／mL,蛋白回收率在94．33％～109．33％之间,CV均〈10％,具有良好的重复性;检测30例正常人血清样本中Fibulin-1的含量约为（31±8）μg／mL。结论建立的ELISA方法可用于检测血清中的Fibulin-1蛋白含量。     

灰霉菌多克隆抗体的制备与鉴定

建立了一种新的检测灰霉菌的方法.利用灰霉菌培养基中分离得到的菌丝体上清波抗原和孢外多糖抗原,通过免疫Balb/c小鼠后,经离心、沉淀和纯化后得到了灰霉菌抗体.实验结果表明,上清液抗原的的免疫效果要好于孢外多糖抗原的免疫效果.纯化后的抗体的效价大于13 000,最低检测限1 ng/mL.该研究为今后的ELISA法快速检测灰霉菌提供了一些参考依据.     

TLC及HPLC测定红曲产品中的桔霉素

阐述了定性及定量测定红曲产品中桔霉素含量的几种方法.采用板层析（TLC），在点样量为1mL、点样长度5cm条件下通过目视法，标准桔霉素溶液的最低检测质量浓度可达0.2mg/L，板层析可作为定性检验红曲产品中桔霉素的简便方法.根据红曲样品预处理方法及HPLC检测器的不同，确定了两套准确可靠的定量检测方法.高效液相色谱结合荧光检测的最低检测限为0.60ng.HPLC上样液最低可检测的质量浓度为0.1mg/L.在0.1～10mg/L的质量浓度范围内，标准桔霉素溶液的质量浓度与峰面积的线性关系良好，达到R2=0.998.红曲样品桔霉素的测定结果重复性较好.     

催化褪色光度法测定粮食中的痕量铜

基于 pH 6.5的磷酸盐缓冲介质中铜对高碘酸钾氧化胭脂红褪色反应的催化作用 ,提出一种催化褪色光度法测定痕量铜的新方法 ,并研究了该方法的适宜反应条件 .该方法的Cu(Ⅱ )检出限为 1 .1× 1 0 - 7g/L ,线性范围为 1 0mL的比色管中Cu(Ⅱ )含量 0～ 0 .5μg .该方法用于粮食中痕量铜的测定时 ,结果较准确 .     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

趋化因子SDF-1促进基于内源性干细胞归巢的初步研究

目的通过体内、外实验,研究基质细胞衍生因子1(Stromal cell–derived factor-1,SDF1)对细胞的趋化作用。方法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。通过Transwell实验,检测不同浓度SDF1对BMSC体外趋化作用的影响。采用MTT法,检测不同浓度SDF1对BMSC细胞活性的影响。通过将负载SDF1的无纺聚羟基乙酸植入裸鼠皮下,检测SDF1的体内趋化活性。结果10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL SDF1组体外趋化BMSC数目均较对照组增加,其中100 ng/mL SDF1组趋化细胞数目最高。10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL SDF1对BMSC细胞活性无影响,200 ng/mL SDF1可降低BMSC细胞活性。100 ng/mL SDF1可促进体内细胞募集。结论100 ng/mL SDF1可有效促进细胞趋化且对细胞活性无影响。     

前列腺癌间歇内分泌治疗预后因素分析

目的 探讨患者基础情况、PSA动态变化参数等指标对前列腺癌间歇内分泌治疗预后的分析价值.方法 回顾性分析130例符合纳入标准的,采用间歇内分泌治疗方法的前列腺癌患者,进行全雄激素阻断,待PSA小于0.2 ng/mL3 ～6个月后停止用药,再根据每月PSA的检测结果决定是否再行内分泌治疗.如果PSA持续升高且大于10ng/mL,就再次启用内分泌治疗.结果 nPSA小于0.1 ng/mL的患者,从开始间歇内分泌治疗到转变为去势难治性前列腺癌(CRPC)的时间明显延长,RR值为1.487(P=0.036)；PSAV小于-15ng·(mL·year)-1的患者,从开始间歇内分泌治疗到转变为CRPC的时间明显延长,RR值为2.636(P=0.043).结论 对于第一循环能达到nPSA小于0.1ng/mL,PSAV小于-15ng.(mL·year-1的前列腺癌患者,间歇内分泌治疗的效果更好.     

黄曲霉毒素B1完全抗原构建中结合位点研究

通过衍生化反应,合成了AFB1羧甲基活化物,然后利用碳二亚胺法合成AFB1-O-BSA偶联物,构建AFB1完全抗原,并通过多种光谱和质谱对合成完全抗原过程中偶联比和结合位点进行研究。通过荧光光谱在分子水平上探讨AFB1与BSA载体蛋白的偶联机制及偶联反应对BSA的构象影响,推测黄曲霉毒素和牛血清白蛋白反应的结合部位,同时发生在BSA的酪氨酸残基和色氨酸残基上,使得BSA疏水性增加,肽链伸展程度降低。     

固相萃取结合GC/MS法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)是一种基因致癌物,葡萄酒及其它酒精饮料中含有微量的EC.采用固相萃取柱(50 mL,Chem Elut)结合GC/MS方法检测葡萄酒中的EC的最佳参数,结果表明,待测样品最佳pH为自然pH,洗脱剂二氯甲烷的用量为175 mL,样品在柱中的停留时间在10 min以上时,EC的回收率最高.方法的回收率为85.76～102.82%,同一天检测的相对标准偏差(RSD)为4.22～8.20%,隔天检测的相对标准偏差为4.60～10.13%,方法的检出限为3.0 μg/L.     

转化生长因子-β1对人软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA及其阻滞剂mRNA表达的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人透明软骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其阻滞剂T(IMP-1)mRNA表达的作用及相关意义,更好地理解骨关节炎软骨损伤的相关机制。方法TGF-β1作用于传代培养的人软骨细胞12h,浓度分别为1ng/mL、10ngm/L、100ng/mL;上述不同浓度TGF-β1与白介素-1β(IL-1β)10ng/mL组成联合作用组,继续培养12h。应用逆转录PCRR(TP-CR)方法及实时荧光定量方法(FQP-CR),检测TGF-β1及其与IL-1β联合作用于传代培养的人透明软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的含量。结果正常对照组透明软骨细胞可见MMP-1、TIMP-1mRNA扩增产物,而实验组TGF-β11ng/mL、10ng/mL、100ngm/L作用于透明软骨细胞12h后,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高;TGF-β1与IL-1β联合作用后,随着TGF-β1浓度的升高,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高,各组之间差异有显著性意义(P<0.05)。提示TGF-β1与MMP-1、TIMP-1mRNA表达之间存在剂量依赖关系。结论不同浓度TGF-β1按照剂量依赖方式抑制人软骨细胞MMP-1mRNA基因的表达,刺激人软骨细胞TIMP-1mRNA基因表达;TGF-β1具有对抗IL-1β对人软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的作用,也呈现剂量依赖关系。研究结果对揭示骨关节炎的发病机理,指导其治疗具有积极意义。