Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.     

重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间.结果表明:培养基起始pH 7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37 ℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍.采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景.     

魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件

研究了利用黑曲霉(Aspergillus niger)E-56菌株所产高活力β-甘露聚糖酶水解魔芋葡甘露聚糖的工艺条件.在单因素试验的基础上,进一步通过正交试验确定酶法制备甘露低聚糖的最佳工艺条件为:魔芋胶质量浓度240 g/L(去离子水配制),加酶量为120 U/g,50 ℃酶解8 h.在该工艺条件下,酶解液中葡甘露低聚糖的平均聚合度(DP)在1.8～1.9范围内.     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

米曲霉ASP-m21产果胶酶及其酶学性质

以产果胶酶PG为主的米曲霉(Aspergillus oryzae)为出发菌株进行固态发酵研究.确定最适合发酵条件为:以30 g/dL麸皮,8 g/dL橘皮粉,添加2 g/dL的泡沫材料作为透气支撑载体,每千克原料添加8 g硫酸铵,10 g葡萄糖,接种体积分数为10%,经过42 h发酵,最终果胶酶酶活可达807 U/g(干曲计).果胶酶的最适反应温度为50 ℃,最适pH范围在3.0～3.6之间.试验结果表明:果胶酶在3.0～7.0的pH的范围内,适合产物生成速度最大的pH点在3.6左右,产物生成速度为0.3 mmol/(Lmin);50 ℃是酶促反应的最适温度,在30 min条件下生成的产物最高可达9 mmol/L.在桔子澄清实验中,向含有体积分数30%的橙汁中添加酶活为1 U/mL的果胶酶,分解果胶为半乳糖醛酸,并且随着半乳糖醛酸量的增加,橙子浆的黏度降低,透光率增加.反应7 h后,透光率可高达91.1%.     

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药性分析及CTX-M酶的检测

目的 分析北京地坛医院产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β lactamases,ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的耐药情况及其携带CTX-M酶的基因类型.方法 对北京地坛医院2006年8月至2007年7月期间收集的无重复21例产ESBLs菌株,采用微量药敏定量实验检测20种抗生素的最小抑菌浓度,用针对CTX-M基因的特异性引物进行PCR扩增并确定其基因型,PCR产物进行克隆测序.结果 21例菌株对大多数β-内酰胺类药物明显耐药,多数对氨基糖苷类和氟喹诺酮类耐药,但对亚胺培南100%敏感;产CTX-M酶的有10株,其中有7株产CTX-M-14酶,2株产CTX-M-3酶,1株产CTX-M-9酶.结论 北京地坛医院2006年8月至2007年7月期间产ESBLs菌多为多重耐药菌,并且存在CTX-M酶的流行,主要是CTX-M-14酶和CTX-M-3酶.     

氮离子束诱变提高黄嘌呤氧化酶产生菌产酶能力

通过氮离子束诱变节杆菌(Arthrobacter sp.g-1984)筛选到黄嘌呤氧化酶高产菌株X7,产酶活力为24.49 U/g,是出发株产酶活力(8.81 U/g)的2.78倍,经发酵条件优化后,产酶活力达到36.67 U/g,是出发菌株产酶活力的4.16倍,产酶高峰缩短了21 h.对细菌黄嘌呤氧化酶酶学性质进行了初步研究,其最适反应条件为37℃、pH 6.5、Fe2 对酶活力有较强的抑制作用,EDTA对酶活力有明显的激活作用.     

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺，系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）β-D-半乳糖苷酶。K．fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K．fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的Hiprep^R 16／10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26／60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化，酶的回收率为27％，纯化倍数为42。纯化的K．fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，呈现一条染色谱带，表明纯化的酶具有较高的纯度。K．fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60 000。     

咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性检测

目的:初步证实咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性.方法:通过PCR扩增得到咖啡豆α-半乳糖苷酶基因克隆到载体pGEM-T easy,目的片段与预期的大小一致.咖啡豆α-半乳糖苷酶基因与分泌性原核表达载体pAS18连接,转化到宿主菌E.coli JM83.经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳分析,Western-blot印迹证实蛋白表达的特异性.结果:PCR扩增得到目的片段测序结果正确.SDS-PAGE电泳分析得到目的蛋白41 kD,经过Western blot鉴定正确.ELISA检测证实咖啡豆α-半乳糖苷酶具有生物活性.结论:优化诱导条件,初步证实重组咖啡豆α-半乳糖苷酶基因具有生物活性.     

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的芽孢杆菌Sx菌株,经16S rRNA测序分析,结合菌体及菌落的形态特征,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其产酶条件与酶学特性进行了研究.结果表明,以l g/dL玉米淀粉和2 g/dL豆粕粉为碳氮源,pH 6.5,30℃,220 r/min,60 h的条件下,菌株所产CGTase酶活性可达5 596 U/mL;该酶在30～50℃,pH 5.5～9.0下保持稳定,在50℃,180 r/rain,pH 6.5,CGTase酶活力为1 107 U/mL的条件下对20 mg/ml,甜菊甙转化48 h,甜菊甙溶液中的昂莱鲍迪甙与甜菊甙的比值(RA/SS)从转化前的0.45上升到0.53.     

pH对衰老相关β-半乳糖苷酶染色的影响

目的观察正常老化及应激诱导老化（stress—inducedprematuresenescence,SIPS）的小鼠成纤维细胞在不同pH值条件下,衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence—associatedp—galactosidase,SA—β-Gal）染色效果的变化规律。方法取新生1～3dC57BL／6小鼠背部皮肤成纤维细胞进行传代培养,UVB照射应激诱导老化细胞,以不同代次的细胞和应激诱导老化细胞为实验对象,进行衰老相关蛋白检测,并在不同pH条件下进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色,对其着色情况进行观察和分析。结果在P1代细胞、P6代细胞、应激诱导老化细胞和P12代细胞中,p53／p21蛋白表达依次增多;正常P1代细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色阴性,其余细胞组随着pH值的由低到高（6．0～8．0）,着色情况均呈现由强到弱的变化趋势,P6细胞、SIPS细胞、P12细胞分别在pH7．0、7．5和8．0时阳性染色消失。结论随着细胞衰老程度的增加,衰老相关p一半乳糖苷酶染色将在较高pH时才会呈现假阴性,提示染色时安全pH范围应根据细胞代次而定。     

产新德里金属β-内酰胺酶肠外致病性大肠埃希菌的分子分型

目的对产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)的肠外致病性大肠埃希菌(ExPEC)进行多位点序列分型(MLST)和系统发育分群研究。方法收集2016年2月至2018年2月分离自武汉大学人民医院临床送检标本中对亚胺培南和(或)美罗培南敏感性降低(MIC≥2μg/ml)的ExPEC菌株。改良Hodge试验(MHT)对碳青霉烯酶进行表型确证。PCR检测碳青霉烯酶编码基因blaNDM。Sanger测序法检测各碳青霉烯酶基因亚型。采用MLST分型和系统发育分群对PCR检测出的产NDM ExPEC菌株的分子流行病学特征进行分析。结果共收集到对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的ExPEC菌株20株,其中产NDMExPEC菌株15株。MHT检测产NDMExPEC菌株的敏感度和特异度分别为93.3%(14/15)和80.0%(12/15)。15株产NDM ExPEC菌株中11株(73.3%)产NDM-5型,4株(26.7%)产NDM-1型。系统发育分群结果显示,15株产NDM ExPEC菌株中,13株属于A群,2株属于D群。MLST分型结果显示,ST410是产NDM ExPEC菌株中检出率最高的ST型(5株,33.3%)。结论本院绝大多数产NDM ExPEC菌株属于毒力较小的系统发育群,应加强院感监测,防止高危克隆ST型的暴发流行。     

半纤维素酶高产菌种的选育及产酶条件

以黑曲霉WA301为出发株,经过紫外诱变获得一株遗传性状稳定的半纤维素酶的高产突变株WA9024.通过对培养基中碳源、氮源、水分和起始pH值的优化,突变株WA9204以麸皮为基质的固态发酵产半纤维素酶的能力进一步得到提高.在较适的条件下,WA9024的甘露聚糖酶酶活达到8984U/g,木聚糖酶酶活达到503U/g,分别比出发菌株提高了1160%和210%.     

黑曲霉VVTP84生产果糖转移酶

从产果糖转移酶的 11株菌株中筛选出一株黑曲霉VVTP84菌 .该菌株在含蔗糖的培养基中 ,最佳摇瓶发酵时间为 30h ,pH值为 7.0 ;当蔗糖质量浓度在 2 5 0g/L以内时 ,产酶与蔗糖质量浓度呈正相关 ;MgSO4 ·7H2 O和KH2 PO4 的添加量分别以控制在 1.5 g/L和 1.0 g/L为宜     

中性纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件

通过紫外线和γ射线交替诱变,筛选得到一株高产纤维素酶的突变菌株BE40 39.与出发株相比,其产酶能力提高1.3倍,发酵性状与出发菌株也有明显的差异.突变菌株发酵试验发现,Avicel是突变菌株产酶最合适的纤维素质碳源.通过对发酵培养条件的试验,得出最佳培养条件是:Avicel质量浓度为0.1g/dL,胰蛋白胨质量浓度为0.3g/dL,最适发酵温度为30℃,最佳培养基初始pH4.2,发酵5d达到产酶高峰.     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus的耐热β 半乳糖苷酶基因bgaB被克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中,然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体pSAS144中,转化Bacillussubtilis受体菌BD170,在5μg/mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子.经摇瓶发酵后,得到耐热乳糖酶的比酶活为0.32U/mg,是出发菌株比酶活的2倍.     

L-组氨酸产生菌的选育

以谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum )ATCC 1376 1为出发菌株 ,经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍 (NTG)诱变处理 ,D 组氨酸 (D His)、6 氮鸟嘧啶 (6 AU)等结构类似物平板和以L 组氨酸 (L His)为惟一氮源平板定向筛选 ,获得一株L 组氨酸产生菌H 2 4 (D Hisr 6 AUrHisase- ) .在加有 15 0 g/L葡萄糖、35g/L硫酸铵以及 10mL/L玉米浆的发酵培养基中发酵 72h ,产L 组氨酸 1.6 g/L.     

淫羊藿苷对衰老骨髓间充质干细胞成骨的影响

目的 探究淫羊藿苷（icarrin，Ica）对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨的影响及机制。方法 通过全骨髓贴壁法提取BMSCs，采用流式细胞术及成骨、成脂诱导分化鉴定细胞。通过CCK8法检测D-gal及Ica处理BMSCs的最适浓度，用D-gal诱导BMSCs衰老，药物干预48 h；6SA-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况；碱性磷酸酶试剂检上清液ALP水平；RT-PCR和Western Blot分别检测BMSCs中衰老相关P16、P53、P21及成骨相关Foxo3a、β-catenin的蛋白表达。结果 BMSCs表面标志物CD44和CD90表达大于95%；CD34、CD45表达小于5%，且能被定向诱导分化出钙结节及脂滴，鉴定细胞为BMSCs。CCK8检测出30 mg/mL为D-gal的最适浓度，10-8、10-10 mol/L为Ica最适浓度。Ica能减少衰老BMSCs中P16、P53、P21 mRNA的表达；降低Foxo3a mRNA和蛋白表达，增加β-catenin mRNA和蛋白的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 D-gal能够诱导构建出衰老BMSCs模型；Ica增加了衰老BMSCs上清液中的ALP含量、降低了衰老BMSCs中 P53的表达水平，可能通过调节成骨相关信号通路Foxo3a/β-catenin表达，起到对衰老BMSCs成骨分化能力的改善作用。     

一株低温脂肪酶产生菌的筛选鉴定与产酶发酵初探

从无锡惠山采集的土样中筛选得到一株产低温脂肪酶的细菌,经形态和16S rDNA序列鉴定,命名为Serratia marcescens SYBC Y-R.利用合成培养基初步确定摇瓶发酵产脂肪酶的最适碳源为乳糖(质量浓度2.5 g/L),最适氮源为氯化铵(质量浓度1.5 g/L),钙离子明显地促进了该菌发酵产脂肪酶.     

黑曲霉产木聚糖酶的特性

研究了木聚糖酶产生菌黑曲霉(A.niger)238的产酶特性和麸曲的浸提条件,并对其浸提酶液进行浓缩.结果表明,菌株黑曲霉(A.niger)238产木聚糖酶受诱导物的影响,发酵时间在68～72h期间达到产酶高峰,酶活力为286U/mL.最佳氮源为(NH4)2SO4,装料量为每瓶10g,接种量为每瓶0.3mL.其发酵麸曲用固液比为1∶5的2g/dLCaCl2溶液,30℃浸提1.5h;浸提液采用25℃,40kPa,冷却水温度18℃条件超滤浓缩可获得90%以上回收率.