DC细胞刺激γδ T细胞的抗白血病作用

目的研究γδ T细胞的体外生存期和抗白血病活性. 方法对外周血采集物用GM-CSF+IL-4进行培养,使其分化和扩增为树突状细胞(dendritic cells, DC);然后用DC和细胞因子IL-2刺激其CD4+ T细胞扩增后,协同DC共同刺激γδ T细胞扩增,再与多种白血病细胞株进行混合培养,进而用MTT比色法研究抗白血病能力. 结果γδ T 细胞能在体外长期大量扩增.扩增的γδ T细胞对多种白血病细胞株具有杀伤作用. 结论γδ T细胞可望用于白血病的临床免疫治疗.     

树突状细胞刺激γδT细胞扩增诱导干细胞移植时GVL研究

目的：研究γδＴ细胞的体外生存期,抗白血病活性及可能引起的移植物抗宿主反应（ＧＶＨＤ）,为自体及异体移植后输注γδＴ细胞诱导移植物抗白血病反应作前期基础研究。方法：对移植患者采集物用ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４进行培养,使其分化和扩增为树突状细胞（ＤＣ）;然后用ＤＣ和细胞因子ＩＬ－２刺激其ＣＤ４＾＋Ｔ细胞扩增后,协同ＤＣ共同刺激γδＴ细胞扩增,进而用ＭＴＴ比色法和ＣＦＵ－ＧＭ集落培养研究其功能。结果：γ     

人慢性髓性白血病细胞系来源的树突状细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞的免疫功能。方法：用细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL4在体外诱导培养K-562细胞，获得树突状细胞(DC)检测其细胞表型，并观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外抗肿瘤效应。用ELISA法测定DC培养及DC与外周血单个核细胞共培养上清液中IL-12及IFN-γ的量。结果：联合GM-CSF及IL-4可诱导K-562细胞分化为树突状细胞，K-562DC体外激活的CTL对K-562细胞具有特异性细胞毒活性；诱导DC培养上清及DC与外周血单个核细胞共培养上清测出一定量IL-12及IFN-β。结论：人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞表达抗原提呈细胞表型，具有诱导CTL反应和分泌IL—12以及促进T细胞分泌IFN-γ的作用。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的体外扩增培养

目的 :探讨慢性髓性白血病 (CML)来源的树突状细胞 (DC)的体外扩增及其功能 .方法 :采用两步法 ,首先将慢性髓性白血病骨髓或外周血CD34+ 细胞与rhFlt3 L和rhTPO共育 7d,再用rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4诱导培养1 4d ;同时以rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4直接诱导体系作对照 .获得的DC通过免疫表型检测、电镜分析及染色体鉴定 ,并用MTT法检测其刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细胞的杀伤作用 .结果 :两步法培养 2 1d ,CML的CD34+ 细胞扩增 (76 . 5 6± 5 . 1 7)倍 ,DC产率 (39. 1 0± 8. 0 3) % ,直接诱导产生DC扩增倍数及比例均低于两步法 (P <0 . 0 1 ) ,且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖进而杀伤CML细胞 .结论 :两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率 ,优于直接诱导培养 ;CML细胞来源的DC可诱导抗白血病免疫应答的产生     

白血病细胞源树突状细胞功能测定

目的：观察体外诱导的白血病细胞源树突状细胞（DC）的抗原递呈功能。方法：分离初诊8例急性髓细胞性白血病（AML）、9例慢性髓细胞性白血病（CML）患者和6例正常人的骨髓单个核细胞,用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养。分别于培养第1、6、14天用倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞术检测免疫学表型,用混合淋巴细胞反应检测抗原递呈功能。结果：经诱导培养,AML,CML和正常组骨髓单个核细胞均出现DC典型形态的细胞,而且免疫标记差异无统计学意义（P〉0.05）。混合淋巴细胞反应结果显示,AML-DC、CML-DC和正常DC诱导生成的细胞毒T淋巴细胞（CTL）能够杀灭白血病细胞,AML-DC、CML-DC之间刺激T细胞增殖的能力相似（P〉0.05）,但2者刺激T细胞增殖的能力均低于正常DC（P〈0.05）。结论：急性和慢性白血病细胞均能诱导分化成DC,但其抗原递呈功能较弱。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的：W本外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血单个核细胞（PBMNC）来源的树突状细胞（CML－DC）并测定其表型。方法：取CML患者新鲜抗凝血,用淋巴细胞分离液分离PBMNC,经细胞因子rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNF-α联合刺激培养9－12d,收集培养细胞,光镜形态学分析并细胞计数,结合PE－CD1a单抗、FITC－CD14居流式细胞 （FCM）上进行CML－DC比例及表型分析。结果CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养,CML－DC含是可达3．5％－23．5％,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML－DC含量仅为0．1％－1％,结论CML患PBMNC 体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML－DC,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。     

γδT细胞对宫颈癌细胞体外杀伤作用的探讨

目的:探讨宫颈癌组织中是否存在γδT细胞以及γδT细胞在体外抗肿瘤作用.方法:免疫组织化学法检测10例宫颈癌组织中γδT细胞的数量,固相抗体包被法体外扩增出特异性的γδT细胞后用流式细胞仪检测其纯度,乳酸脱氢酶释放实验检测γδT细胞对宫颈癌细胞株SiHa、HeLa细胞的杀伤能力.结果:免疫组化结果显示人宫颈癌组织中肿瘤浸润γδT细胞阳性染色较癌旁组织显著增强,该细胞通过固相抗体包被法体外扩增30 d之后用流式细胞仪检测细胞表面TCRγδ的阳性率高达(91.2±1.2)％,乳酸脱氢酶释放实验显示体外扩增的γδT细胞能够杀伤宫颈癌细胞株SiHa、HeLa细胞,并且其杀伤效应随效应细胞/靶细胞的比例增高而增强.结论:宫颈癌组织中存在γδT细胞,该细胞在体外对宫颈癌细胞具有杀伤作用,其杀伤效应随效应细胞/靶细胞的比例增高而增强.     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

卡介苗活化的CD1-限制性细胞毒T细胞的抗膀胱癌效应

为研究卡介苗（BCG）活化的T细胞亚群在抗膀胱癌效应中的作用，通过细胞因子（IL－4与GM－CSF）体外诱导而获得高表达CD1分子的抗原提呈细胞，然后用BCG抗原致敏抗原提呈细胞以激活各T细胞亚群，比较BCG活化的T细胞亚群对膀胱癌细胞株T24生长抑制效应。结果表明：BCG活化的CD1－限制性T细胞具有明显的抗瘤活性，CD4^ T细胞和γδT也发挥抑制瘤细胞生长的作用。该研究结果提示具有非特异免疫功能的T细胞亚群在BCG抗膀胱癌效应中发挥重要作用。     

急性髓细胞白血病树突状细胞诱导T细胞对自体白血病细胞毒性作用的研究

目的　研究急性髓细胞白血病 (AML)树突状细胞 (DC)诱导 T细胞对自体白血病的细胞毒性作用。方法　分离 AML 患者外周血单个核细胞 (MNC) ,在含有 GM- CSF、IL- 4、TNF- α等刺激因子的培养体系中培养7～ 14 d,通过形态学和免疫表型鉴定 DC。通过反复冻融的方法获取白血病抗原肽 ,分别以白血病抗原肽及白血病抗原肽 - HSP90复合物方式脉冲 DC,再将 DC与自体 T淋巴细胞共同孵育 ,以乳酸脱氢酶的方法检测经不同抗原方式激活的自体 T淋巴细胞对白血病细胞的杀伤效应。结果　急性白血病患者外周血 MNC中培养出 DC为 (6～11)× 10 4 / 10 6 MNC,经两种抗原方式激活的自体 T淋巴细胞对自体白血病细胞的杀伤活性分别为 (6 2 .0 7±8.2 9) %和 (35 .33± 9.0 4 ) % ;体外培养的 AML 患者外周血 MNC可诱导分化出大量 DC。结论　单纯白血病抗原肽与白血病抗原肽 - HSP90复合物方式脉冲的 DC均能够激活自体白血病特异性 T淋巴细胞 ,但后者具有更强的激活能力。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

B7转染白血病细胞K562的作用研究

目的：探讨共刺激信号分子B7转化人白血病细胞株K562后,转化细胞的生物学性状变化及介导的免疫作用。方法：构建重组真核表达质粒pcDNA3．1B7,转化人白血病细胞株K562,获得单个细胞克隆,观察K562－B7的生长周期,绘制生长曲线,检测K562－B7诱导T细胞分泌IL－2的情况。结果：pcDNA3.1B7可在K562中稳定表达,K562－B7的生长增殖速度比野生型K562慢。在体外,K562－B7可诱导PMNC分泌IL－2,24h上清液中IL－2含量比B7阴性K562高1倍左右。结论：B7基因转入白血病细胞株K562后,细胞本身增殖能力降低,且K562－B7可活化CD4^ T细胞分泌细胞因子IL－2,提高宿主抗肿瘤免疫能力。     

树突状细胞的制备及其辅佐功能的实验研究

目的 探讨应用外周血体外扩增树突状细胞(DC)的方法及DC的辅佐功能。方法 分离人外周血单核细胞，应用GM—CSF，IL—4及TNF—α培养观察，并应用MTT法检测DCs在同种混合淋巴细胞反应(MLR)中激发同种T淋巴细胞增殖的能力。结果 经体外诱导扩增，可将外周血单核细胞定向诱导大量的具有典型DC形态的树突状细胞。混合淋巴细胞反应结果提示，只需少量DC，即可强烈激发同种T淋巴细胞增殖。结论 (1)用GM—CSF、IL—4及TNF—α能从人外周血诱导、扩增出DC；(2)DC具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

树突状细胞对APL凋亡细胞溶解抗原交叉提呈诱导产生的抗白血病效应

目的:研究树突状细胞(DC)在体外对恶性肿瘤凋亡细胞溶解抗原交叉提呈的可能性及由此诱导产生的抗瘤效应.方法:用As2O3体外诱导急性早幼粒白血病(APL)细胞凋亡.取患者完全缓解期(CR)外周血单个核细胞(PBMNC)体外诱导DC,体外进行APL凋亡细胞溶解抗原(ALA)负载,并设APL细胞溶解抗原(CLA)负载对照,ALA-DC激自体T细胞,流式细胞术分析DC,T细胞免疫表型.51Cr释放法测定T细胞对APL细胞杀伤活性.结果:APL细胞经2 μmol/LAs2O3体外诱导5 d,凋亡率为(86±4)%;自体T细胞被DC激化前,CD2 ,CD3 ,CD8 T细胞百分率为(27±5)%;被ALA-DC激活后,CD2 ,CD3 ,CD8 T细胞百分率上升至(50±12)%,对照组下降至(22±4)%.细胞毒性实验示ALA-DC激活的自体T细胞对APL细胞的杀伤活性明显强于对照组(P＜0.01).结论:APL凋亡细胞溶解抗原能被DC交叉提呈,激活CD8 CTL细胞,其诱导的抗白血病效应强于非凋亡细胞溶解抗原致敏的DC.     

细胞因子诱导不同来源的贴壁细胞分化为树突状细胞的研究

目的：探讨寻树突状态细胞（DC）体外培养的理想来源。方法：通过贴壁的方法分离脐带血、造血动员后的外周血及正常人外周血中DC的前体细胞，体外采用细胞因子诱导，并对其进行形态学的观察和细胞表型检测；同时比较了不同来源的DC的增殖、分泌IL－12的能力及激发同种异体T细胞和脐带血幼雅T细胞（naive Tcells)的作用，结果：经过造血动员后的外周血产生的DC数量和纯度均较高，而且能经体外细胞因子诱导为功能性DC。结论：造血动员后的外周血是较理想的DC来源。     

肿瘤坏死因子—α预刺激对培养树突状细胞形态学的影响

目的：研究肿瘤坏死因子（TNF）－α预刺激对树突状细胞形态学的影响，方法：Ficoll密度梯度离心分离健康人外周血，获得单个核细胞，培养基用含有10％胎牛血清的RPMI 1640，分两组进行培养，一组用TNF－α预刺激4h后加入粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白细胞介素－4（IL－4），每48h再次加入上述3种细胞因子；另一组则在培养初始加入GM－CSF及IL－4，每隔48h再次加入上述2种细胞因子，第5天加入TNF－α，两种中所用细胞因子浓度完全一样，且均于第8天收获细胞，前者记作T－DC，后者记作DC。光镜及扫描电镜观察DC形态学变化及差异，结果：T－DC与DC相比，具有更多，更典型的树突状突起，结论：TNF－α预刺激DC前体细胞4h与TNF－α在培养第5天加入相比，所诱导出的DC的树突状形态更为明显，典型。     

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用。方法 分离外周血单个核细胞,应用GM－CSF及IL－4诱导DC产生,用TNF－α和PGE2促进其成熟,并用肺癌细胞系GLC－82可溶性抗原致敏。将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC－LAK）,用MTT法检测DC－LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 经GM－CSF,IL－4,TNF－α,PGE2作用后,细胞表达CD1a阳性率为71．0％,CD8350．0％,CD14阳性率低于10．0％,高表HLA－I,HLA-Ⅱ和CD45,为典型的DC表型特征。DC－LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC－82,A549,moser和MCF－7）的杀伤率,前为84．7％,66．9％,49．3％和56．0％,后为43．5％,31．3％,45．0％和32．4％。结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC。     

IL—6对地塞米松诱导AML细胞凋亡的影响

目的：检测ＩＬ－６对原代白血病细胞的影响，探讨其在地塞米松耐药机制中的作用。方法：①不同条件下体外培养原代白血病细胞，用ＭＴＴ法了解细胞增殖情况，②用形态学观察和原位末端标记法检测不同培养条件下ＨＬ－６０细胞株的细胞调亡。结果：①ＩＬ－６可显著促进ＡＭＬ细胞增殖（Ｐ〈０．０５），对ＡＬＬ细胞则无影响（Ｐ〉０．０５），②地塞米松显著抑制ＡＭＬ细胞增殖（Ｐ〈０．０５），且这种抑制在部分病例可被ＩＬ－６     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。