成人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血，肝素抗凝，Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13，CD44，CD71，CD166）。但不表达造血细胞抗原（CD34，CD45），这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清共孵育，对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

共培养系统下骨髓间充质干细胞分化为颌下腺腺泡细胞的实验研究

目的 研究使用共培养系统将骨髓间充质于细胞分化为有分泌功能的颌下腺腺泡细胞的可行性.方法 分离成年SD大鼠骨髓间充质干细胞于体外培养、纯化和鉴定,同时分离新生SD大鼠的颌下腺细胞于体外培养、纯化和鉴定,取颌下腺腺泡细胞第二代和间充质干细胞第一代置于共培养系统诱导干细胞定向分化.使用免疫细胞化学法分析骨髓间充质干细胞是否表达淀粉酶抗体.结果 纯化后的颌下腺腺泡细胞呈铺路石样形态,原代至第5代培养基及细胞内均可检测到淀粉酶表达;体外培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,呈束状、漩涡状排列,可成功诱导成脂肪细胞,油红-O染色显示含有脂滴;共培养后的骨髓间充质干细胞表达淀粉酶抗体,约30%的骨髓间充质干细胞在共培养1周后转化为腺泡细胞,约50%的骨髓间充质干细胞在共培养2周后转化为腺泡细胞.结论 成功构建大鼠颌下腺腺泡细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养体系,并证明大鼠骨髓间充质干细胞具有转化为腺泡细胞的能力,因此骨髓间充质干细胞将有望应用于涎腺组织工程.     

小鼠骨髓干细胞的分离培养鉴定及诱导分化的研究

目的分离培养鉴定小鼠的骨髓间充质干细胞,观察体外培养生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力。方法采用全骨髓培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞,观察干细胞的形态和生长特性,用流式细胞仪对其细胞表型CD29、CD90、CD34、CD44、CD31、CD45进行鉴定,成脂成骨诱导分化能力鉴定。结果原代分离的细胞培养24 h,干细胞开始贴壁,胞体呈圆形,其他血细胞悬浮。培养3 d,贴壁细胞逐渐变梭形;培养第4 d,细胞开始分裂;随着细胞数目的增加,逐渐形成漩涡状排列,细胞形态呈梭形、三角形、多边形、不规则形;培养第10 d,贴壁细胞长满瓶底的80%,按1∶2传代。选择第3代骨髓干细胞分析显示,CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达。细胞成脂成骨诱导后染色鉴定呈阳性。结论采用全骨髓法培养可获得生长状态良好,增殖能力强的骨髓间充质干细胞,方法简便、实用。     

骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖的负调控作用及其机制的探讨

目的：研究成人骨髓间充质干细胞（mesenehymalstemeeHs，MSCs）的免疫调节作用及其作用机制。方法：从成人骨髓中分离、培养问充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞培养上清置于96孔板中，与经分离的异体淋巴细胞共培养3d，以单独培养的异体淋巴细胞为对照组，加入植物凝血素（PHA）刺激72h，用MTT还原法测定细胞增殖，观察成人骨髓MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖转化的影响。结果：成人骨髓MSCs培养上清抑制异体淋巴细胞增殖转化。两者差异有显著性（P〈0．05），其增殖转化抑制率为9．00％。在有PHA刺激淋巴细胞增殖的情况下，细胞增殖活性进一步下降，两者差异显著（P〈0．01），其增殖转化抑制率达20．91％。结论：成人骨髓MSCs抑制异体淋巴细胞增殖转化，其作用机制部分为非细胞接触作用所致。推测可能是MSCs通过分泌某些可溶性细胞因子而发生作用。     

在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为表皮细胞的可行性，方法：抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后，应用5－溴脱氧尿嘧啶（5－BardU)标记技术进行细胞标记。将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的香猪的皮内及皮下，分别于注射后1，2周取材，常规石蜡包埋，连续切片，行5－BrdU和角蛋白免疫组织化学染色，对比研究。结果：大多数5－BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围。但有少数5－BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层，并同时表达角蛋白，结论：在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表歧细胞的潜能。     

BMP12转染骨髓间充质干细胞的瞬时表达

目的 以骨形态发生蛋白12(BMP12)基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化为肌腱细胞的可行性。方法 将携带有BMP12基因的质粒pEGFP-C1,采用电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 转染后6h可见细胞内有GFP表达,12h后达高峰,持续约3天,其后有些细胞荧光开始减退。结论 BMP12基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓向间充质干细胞定向分化为肌腱细胞具有可行性。     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)理想的分离、培养方法。方法采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养人骨髓干细胞,并将其分别置于普通培养瓶6、0Co培养瓶中培养,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间充质干细胞;流式细胞术检测细胞表面标志。结果人骨髓干细胞呈均一梭形、成纤维细胞样,形成集落样生长。60Co培养瓶细胞贴壁情况明显好于普通培养瓶,且费用低;免疫组化及流式细胞术显示CD34、CD45表达为阴性,CD29、CD44表达为阳性。60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养简单易行,骨髓干细胞增殖快,活性好,传代力持久。可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究与临床应用提供了实验方法及依据。     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

高原红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞的培养

目的：对高原红细胞增多症（HAPC）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）进行分离培养,为进一步探讨其生物学特性奠定基础。方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例HAPC和10例正常人骨髓MSCs进行分离培养,倒置显微镜下观察MSCs形态,流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,判断其增殖能力。结果：骨髓密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34和HLA-DR（P〉0.05）。HAPC骨髓MSCs增殖能力高于正常骨髓（P〈0.01）。结论：HAPC患者骨髓MSCs体外可有效分离培养,所培养的细胞成分单一,可供进一步实验应用。     

胎儿骨髓间充质干细胞的体外培养及其生物学特性的研究

目的：确定人胎儿骨髓间充质干细胞(Fetal mesenchymal stem cells，FMSCs)体外分离和培养的方法，观察其生物学特性，建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养人FMSCs，观察细胞的形态与超微结构，并研究其增殖及生长特征，应用流式细胞术测定细胞周期和CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果：在体外培养条件下人FMSCs贴壁生长，为成纤维细胞样，CD14／CD34／CD45阴性，CD29／CD44阳性，核浆比大，细胞周期检测C0／C1期约占95％，具有原始细胞的特征。结论：体外培养可获得较均一的FMSCs，形态单一、生长稳定、增殖性较强，可以用于细胞治疗的进一步研究。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

Survivin在骨髓间充质干细胞中的表达研究

目的：培养鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）,检测survivin的表达。方法：应用Ficoll法分离培养MSCs,流式细胞仪检测其特异性表面标志物,RT—PCR检测survivin mRNA表达。结果：培养MSCs的超微结构显示了干细胞特性,流式细胞仪检测证实为MSCs,survivin mRNA表达阳性。结论：Survivin在正常人骨髓间充质干细胞中有表达,提示它可能参与了其生物学行为并影响间充质干细胞存活。     

人骨髓间充质干细胞定向成骨诱导中碱性磷酸酶对其成骨能力的影响

目的 探讨定向诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)分化为成骨细胞过程中,碱性磷酸酶(ALP)对hBMSCs成骨能力的影响. 方法抽取骨髓,梯度离心法分离单个核细胞,在DMEM条件培养基诱导hBMSCs定向分化为成骨细胞;相差显微镜观察成骨细胞形态,MTT法检测成骨细胞增殖,测定成骨细胞ALP分泌量及成骨细胞胞内ALP含量,RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA的表达. 结果梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的hBMSCs;体外定向诱导过程中,成骨细胞ALP含量和ALP mRNA的表达在定向诱导10 d左右开始显著升高,成骨细胞的增殖能力明显增强.随着传代次数的增加,成骨细胞的增殖能力和碱性磷酸酶分泌量以及ALP mRNA的表达呈下降趋势,与BM-Purple染色结果一致. 结论 hBMSCs经定向诱导后可以分化为成骨细胞,ALP含量的变化能够显著影响hBMSCs诱导成骨的能力.