骨碎补总黄酮对晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化及p38和ERKl/2蛋白激酶表达的影响

目的 研究骨碎补总黄酮(TFDF)对晚期糖基化终末产物(AGEs)作用下成骨细胞分化活性及对细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号蛋白的影响,探讨骨碎补总黄酮防治骨质疏松的作用机理.方法 二次酶消化法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞以及活性观察;pNPP、ELISA、茜素红染色法分别检测不同质量浓度晚期糖基化终末产物对成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP)、Ⅰ型胶原(Col I)、骨钙素(BGP)以及矿化能力的影响,并观察骨碎补总黄酮对晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化的干预;Westem-hlot检测骨碎补总黄酮对晚期糖基化终末产物作用下,成骨细胞p38和ERK1/2蛋白磷酸化的影响.结果 晚期糖基化终末产物(200、400、800 mg/L)可以降低成骨细胞表达ALP、Col I、BGP,降低其矿化能力.骨碎补总黄酮可以剂量依赖性的提高晚期糖基化终末产物(400 mg/L)作用下成骨细胞表达ALP、Col I、BGP和矿化能力.骨碎补总黄酮(50 mg/L)可以提高晚期糖基化终末产物(400 mg/L)作用下p38和ERK1/2的蛋白磷酸化.结论 骨碎补总黄酮可以提高晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化和矿化能力,其机制可能和提高p38和ERK1/2信号蛋白的磷酸化有关.     

益骨胶囊含药血清对晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞分化及BMP-2和OPG的影响

目的研究益骨胶囊含药血清对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)作用下成骨细胞分化活性及对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)和骨保护蛋白(osteopro-tegerin,OPG)的影响,探讨益骨胶囊防治骨质疏松(osteoporosis,OP)的作用机制。方法选取10月龄SD雌性大鼠40只,随机分为益骨胶囊高、中、低剂量组及空白组,每组10只。运用大鼠灌胃的方法制备含药血清和对照血清。二次酶消化法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,传代后分为空白对照组、模型组、中药低、中、高剂量组。模型组用AGEs(400mg/L)处理,中药低、中、高剂量组分别用AGEs(400mg/L)和低、中、高剂量含药血清共同处理,分别用pNPP、ELISA、茜素红染色法检测成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,ColⅠ)、骨钙素(bone gla protein,BGP)以及矿化结节,RT-PCR测定成骨细胞中BMP-2、OPG mRNA的表达,ELISA法检测BMP-2、OPG蛋白的表达量。结果原代分离培养的新生大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞特征;与空白对照组比较,模型组成骨细胞(OB)ALP、ColⅠ、BGP、BMP-2、OPG蛋白及BMP-2、OPG mRNA表达降低,矿化结节减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,中药各剂量组ALP、ColⅠ、BGP、BMP-2、OPG蛋白及BMP-2、OPG mRNA表达升高,矿化结节增加,且随剂量增加而明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论益骨胶囊含药血清提高AGEs作用下成骨细胞分化和矿化能力,提高BMP-2、OPG的表达,这可能是益骨胶囊防治OP的机制之一。     

新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞外基质成分沉积的作用研究

目的:通过观察新加糖肾康(简称TSK)对高糖诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的作用,探讨其在防治糖尿病肾间质纤维化方面的作用。方法:将体外培养的HK-2细胞分为6组:空白对照组、高糖诱导组(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清对照组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加TSK低浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+5%新加TSK药物血清)、新加TSK中浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%新加TSK药物血清)、新加TSK高浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+20%新加TSK药物血清)。药物干预后,ELISA法检测ColⅠ、ColⅢ和FN的含量。结果:高糖诱导后细胞外基质成分显著增加,与空白对照组相比有显著性差异(P0.05)。但经新加TSK干预后其含量开始下降,与高糖诱导组相比有显著性差异(P0.05)。结论:中药复方新加TSK能够抑制肾小管上皮细胞外基质成分的分泌,具有防治糖尿病肾间质纤维化的作用。     

左、右归丸含药血清通过p38MAPK信号通路干预BMSCs成骨诱导的研究

目的:基于p38信号通路探讨左、右归丸含药血清对BMSCs成骨诱导的机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠BMSCs;分别以左归丸、右归丸、两方共同药、滋肾阴药、补肾阳药、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)、诱导剂和空白含药血清组共8组对BMSCs进行干预,采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法检测钙化结节,采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)、p38、p-p38蛋白表达,采用real time PCR法检测Cbfα1、ColⅠmRNA表达。结果:左、右归丸及滋阴药组可以上调ALP表达,促进BMSCs矿化结节形成,增强Cbfα1、ColⅠmRNA和蛋白的表达并且可以促进p38蛋白的磷酸化;给予p38特异性阻滞剂SB203580后,各组BMSCs ALP表达下调,矿化结节形成减少,p38蛋白磷酸化水平降低,并且Cbfα1、ColⅠmRNA和蛋白的表达下降。结论:左、右归丸及其拆方含药血清可能部分通过p38 MAPK信号通路对BMSCs成骨分化产生调控作用的。     

补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化GSK-3β、p38MAPK及ERK1/2蛋白的影响

目的:观察补肾活血复方含药血清对大鼠成骨细胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的作用。方法:3月龄SD雌性大鼠灌胃制备空白血清和含药血清,并分离培养1日龄新生鼠颅骨成骨细胞。实验分为空白血清组和含药血清组,分别采用MTT、ELISA、Western-blot等方法检测两组成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌及磷酸化GSK-3β、p38 MAPK和ERK1/2蛋白的变化。结果:与空白血清组相比,含药血清组可明显促进成骨细胞的增殖、ALP和BGP的分泌,并促进胞内磷酸化p38 MAPK和ERK1/2蛋白的表达,对磷酸化GSK-3β蛋白的表达未见明显影响。结论:补肾活血复方含药血清可促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,提高p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平。     

回回甘松饮含药血清对高糖诱导的小鼠肾足细胞的LncRNA-PVT1及相关信号通路的影响

目的研究回回甘松饮(Hui-hui Gan-song Yin,HGY)对高糖诱导的小鼠肾足细胞Lnc RNA-PVT1、FN、ColⅠ基因及蛋白表达的影响。方法体外培养小鼠肾足细胞,分为:正常对照组、高糖组、坎地沙坦(阳性)组、HGY高、中、低剂量组。除正常对照组给外,其余各组分别给予25mmol/L葡萄糖+5%正常小鼠鼠血清、坎地沙坦(1mg/kg)组小鼠血清、HGY(5、10、20g/kg)组大鼠血清干预24小时。细胞培养结束后,采用RT-PCR方法和ELISA法检测Lnc RNA-PVT1、FN、ColⅠ的基因及蛋白表达水平。结果高糖(25mmol/L)使MPs中Lnc RNA-PVT1、FN、ColⅠ基因及蛋白表达量升高(P0.01),HGY含药血清可下调高糖诱导的MPs中Lnc RNA-PVT1、FN、ColⅠ的基因及蛋白表达量(P0.01,或P0.05),且与坎地沙坦含药血清的调控结果接近,无显著差异。结论 HGY含药血清可调控MPs在高糖环境下的Lnc RNA-PVT1、FN、ColⅠ的基因及蛋白表达水平,可能是其延缓早期DKD所致RF进程的机制之一。     

银杏叶提取物对高糖环境下系膜细胞血小板源性生长因子-B表达的影响

目的:观察银杏叶提取物对高糖培养条件下系膜细胞外基质产生及血小板源性生长因子-B(PDGFB)表达的影响。方法:体外培养人肾小球系膜细胞,分为对照组(葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L)、高糖组(葡萄糖终浓度为30 mmol/L)、银杏叶提取物干预组(12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L),采用实时定量PCR检测系膜细胞PDGF-B m RNA的表达、Western blot检测系膜细胞PDGF-B蛋白表达、ELISA检测上清液Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(Fn)含量。结果:高糖组刺激24 h后,细胞上清液中Fn、ColⅣ含量、系膜细胞PDGF-B m RNA及蛋白的表达均高于对照组(P0.05);银杏叶提取物干预组(25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)作用24 h后,细胞上清液Fn、ColⅣ含量均低于高糖组,系膜细胞PDGF-B m RNA及蛋白的表达均低于高糖组(P0.05);且银杏叶提取物浓度越高,该作用越明显。结论:银杏叶提取物可以呈浓度依赖性抑制系膜细胞PDGF-B的合成,从而达到减少细胞外基质聚集、保护肾脏的作用。     

失重下骨碎补总黄酮经MAPK通路促间充质干细胞向成骨细胞分化研究

目的:观察模拟失重状态下,骨碎补总黄酮促间充质干细胞向成骨细胞分化,MAPK/ERK通路变化。方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立失重模型,加入骨碎补血清培养液,观察间充质干细胞向成骨细胞分化过程中形态学变化,MTT法测定细胞活性,PNPP法测定ALP活性,RT-PCR测定MAPK/ERK通路。结果:与空白对照组和低剂量组相比,中、高剂量组细胞增殖能力及ALP活性值均明显升高,且具有统计学意义(P0.05),与阳性对照组接近。加入TFDF后,ERK1/2通路表达明显升高(P0.05)。结论:失重下骨碎补能激活MAPK/ERK通路促间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化成熟。     

葛根素对成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的:探讨葛根素(Pue)对高糖培养的成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原m RNA(CollⅠm RNA)表达的影响,为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供实验依据。方法:取出生24 h内的SD大鼠的颅骨,体外分离培养成骨细胞,待细胞形态稳定后,取对数生长期的成骨细胞,随机分为正常组、高糖组(葡萄糖浓度22 mmol/L)、葛根素各浓度组(葛根素浓度分别为10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)、高糖加葛根素各浓度组,每组设8个复孔,分别培养48 h,隔天换液并加药。测定成骨细胞的增殖能力、细胞内ALP活性以及CollⅠm RNA表达情况。结果:与正常组比较,葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠm RNA表达均显著增高,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01);高糖组、高糖+葛根素各浓度组明显低于正常组,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。与高糖组比较,高糖+葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠm RNA表达均显著增高,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论:高糖情况下抑制成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达,但加入葛根素后能提高成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达,说明葛根素对糖尿病骨质疏松症有治疗作用。     

巴戟天对成骨细胞生物学特性影响的实验研究

目的:观察巴戟天对体外培养成骨细胞(OB)增殖及其活性的影响,探讨巴戟天补肾壮骨作用的实质.方法:取新生SD大鼠头盖骨提取成骨细胞,进行生长曲线分析,测定巴戟天对细胞增殖及分泌ALP、BGP、TGF-β1的影响.结果:巴戟天能显著刺激OB增殖;巴戟天与密钙息均可促进分化中的OB分泌ALP和骨钙素,促进OB表达TGF-β1.结论:巴戟天具有与密钙息相同的作用,即促进OB分泌ALP和骨钙素,促进OB表达TGF-β1mRNA,从而大量分泌Ⅰ型胶原,以利钙盐沉积.     

补肾活血方通过p38 MAPK信号通路影响人成骨细胞功能的机制

目的：观察补肾活血方含药血清对人成骨细胞功能及其对p38 MAPK信号转导通路的活性影响,探讨补肾活血方防治骨质疏松症的作用机制。方法：将人成骨细胞株分为Control组、补肾活血方含药血清组（Z组）、含药血清＋p38抑制剂SB203580组（Z＋SB组）,采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各组成骨细胞的增殖情况,通过PNPP法分析检测成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性,采用免疫印迹（Western blot）法检测和磷酸化p38（p-p38）的表达水平。结果：补肾活血方含药血清能刺激成骨细胞的增殖,使分化增强,与Control组比较有显著性差异（P〈0.01）;阻断p38 MAPK信号转导通路后,与Z组比较,对成骨细胞的增殖无明显抑制（P〉0.05）,而对成骨细胞的分化功能有显著抑制作用（P〈0.01）;Western blot结果显示,补肾活血方含药血清能刺激p-p38表达,阻断p38 MAPK信号转导通路后,p-p38含量明显减少（P〈0.01）。结论：补肾活血方可能通过p38 MAPK通路调控促进成骨细胞分化的功能,起到防治骨质疏松症的作用。     

走马胎活性组分对肝癌HepG2细胞DUSPs/MAPK信号通路的影响

目的 观察走马胎活性组分对肝癌细胞双特异性磷酸酶1/4/5 (1,4,5,DUSP1/4/5) mRNA和蛋白表达及其下游ERK/JNK/p38-MAPK信号通路的影响.方法 走马胎活性组分(4、8 μg/mL)作用肝癌HepG2细胞24、72 h后,分别通过RT-PCR和Western blot检测HepG2细胞DU...     

脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响

目的观察中药延胡索主要有效成分脱氢紫堇碱（DHC）对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞（CFs）增殖和胶原分泌的影响,为延胡索的临床应用提供实验依据。方法采用体外高糖培养的CFs模型进行实验。以胶原酶与胰蛋白酶联合消化分离出生24 h内乳鼠CFs,取2～4代细胞高浓度葡萄糖（25 mmol/L）培养,分别加入100、50、25 mg/L DHC干预,24、48 h后镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA测定Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量。结果 CFs种植3 h后开始贴壁生长,高浓度葡萄糖培养液培养24、48 h后细胞增殖明显增加（P〈0.05,P〈0.01）,48 h后S＋G2＋M期细胞的百分率明显增加（P〈0.01）,细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原量明显升高（P〈0.01）;DHC干预后可显著抑制CFs增殖（P〈0.01）,降低S＋G2＋M期细胞百分率（P〈0.01）,减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌（P〈0.05,P〈0.01）。结论 DHC能抑制高糖培养的CFs的增殖,减少胶原分泌,DHC具有潜在的抗心肌纤维化作用。     

杜仲总提物对大鼠成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的观察杜仲总提取物(DZCE)对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖、分化及分泌Ⅰ型胶原能力的影响。方法体外分离培养大鼠成骨细胞,分为对照组、地塞米松(DEX)10-8mol/L组、杜仲总提取物不同剂量组(10μg/L、1μg/L、0.1μg/L)共5个组,CCK-8(cell counting Kit-8)检测细胞增殖情况。由Pierce BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量,然后由碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒检测成骨细胞的分化情况。用In cell western方法测定成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白(Col1αI)分泌随时间的变化情况。各组干预24 h后,实时荧光定量法检测成骨细胞Col1αI mRNA的表达情况。结果 1杜仲总提取物各剂量均能刺激成骨细胞的细胞增殖(P0.01),同时也都能使成骨细胞的分化能力增强(P0.05)。2药物干预后,Ⅰ型胶原蛋白的分泌随时间的变化情况是第1天的高中剂量,第3天的中低剂量能使成骨细胞的I型胶原蛋白表达提高(P0.05),第5天、第7天、第9天,各组Ⅰ型胶原蛋白的分泌量均增加,但杜仲总提取物各剂量组与空白组差异无统计学意义(P0.05)。3PCR检测发现,杜仲总提取物各剂量组的I型胶原基因的表达增加,而且这种促进I型胶原分泌的能力有量效趋势。结论杜仲总提取物能显著提高成骨细胞增殖、分化和Col1αⅠ的表达。     

黄芩苷对缺氧/复氧小胶质细胞TLR4通路的影响

目的:模拟脑梗塞时脑组织内的缺氧/再灌注病理过程,探索缺氧/复氧对原代培养的小胶质细胞Toll样受体4(TLR4)通路的影响和黄芩苷的干预作用;方法:原代培养小胶质细胞,采用缺氧/复氧的方式制备模型,用黄芩苷25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L3个浓度梯度进行干预,用逆转录聚合酶链反应检测小胶质细胞TLR4 mRNA的表达,Western Blot检测TLR4、抑制因子(I-кB)、p38、ERK蛋白,免疫荧光双染观察髓性分化因子88(MyD88)和核因子кB(NF-кB)。结果:缺氧/复氧激活了TLR4通路,并通过MyD88依赖途径激活了TLR4和下游蛋白MyD88、NF-кB、ERK、I-кB和p38;黄芩苷高剂量组明显抑制了通路中TLR4、MyD88、NF-кB、ERK与p38蛋白的活性和I-кB蛋白的降解。结论:缺氧/复氧激活了小胶质细胞的TLR4通路,黄芩苷通过对TLR4通路蛋白的抑制降低了小胶质细胞的活性,发挥抗炎效应,促进脑缺血的恢复。     

Triggering of p38 MAPK and JNK Signaling is Important for Oleanolic Acid‐Induced Apoptosis via the Mitochondrial Death Pathway in Hypertrophic Scar Fibroblasts

Hypertrophic scarring is characterized by collagen overproduction and excessive deposition of extracellular matrix. No consensus arises currently about the best therapeutics to produce complete and permanent improvement of scars with few side effects. In the present study, the mechanism of oleanolic acid (OA)‐induced apoptosis in hypertrophic scar fibroblasts (HSFs) was investigated for the first time. OA activated the protein phosphorylation of p38 MAPK and JNK but not ERK. OA did not antagonize the inhibitory effects of SB203580 on p38 MAPK pathway activity but sharply enhanced JNK phosphorylation when HSFs were pretreated with SB203580. Similarly, the inhibition of JNK signal pathway activation by pretreatment with SP600125 facilitated the protein phosphorylation of p38 MAPK caused by OA. Inhibition of p38 MAPK and/or JNK by inhibitors significantly enhanced cell viability and OA only partially depressed the increased cell viability. Moreover, OA increased Bax translocation, MMP loss, mitochondrial cytochrome c and AIF release, Bax and caspase‐3 protein expression and the ratio of Bax to Bcl‐2, decreased Bcl‐2 protein expression, and elevated the mRNA expression of Apaf‐1, caspase‐9, and capase‐3. These results suggest that OA elicits apoptosis through triggering of p38 MAPK and JNK signaling and activation of the mitochondrial death pathway. OA might be a good and useful natural drug against hypertrophic scars. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.     

糖肾平胶囊对STZ诱导糖尿病肾病大鼠肾脏保护及其对TGF-β_1/p38MAPK信号转导通路的影响

目的:探讨糖肾平胶囊对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用及其TGF-β1/p38MAPK信号通路影响。方法:雄性Wistar大鼠74只,随机分为正常组10只,模型组64只。模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(45mg/kg),模型成功的大鼠按体质量随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平胶囊低、高剂量组。每周称体质量,隔周分笼收集24h尿液检测24h尿蛋白定量。第14周,处死大鼠取血检测血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;肾组织行HE、Mallory、六胺银染色,观察肾组织的病理形态;肾组织原位杂交、RT-PCR、免疫组化观察转化生长因子β1(TGF-β1)、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表达。结果:模型组大鼠尿蛋白及血清BUN、Scr、TG、MDA含量显著增高(P0.01),NO、SOD含量显著降低(P0.01),肾固有细胞胞浆有大量TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表达;与模型组比较,各治疗组肾脏病理损害明显减轻,尿蛋白及血清BUN、Scr、TG、MDA含量显著降低(P0.01),NO、SOD含量明显增高(P0.01),肾固有细胞胞浆内TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表达明显减少(P0.01),糖肾平治疗组呈剂量依赖关系。结论:糖肾平胶囊可能通过调控糖尿病肾病肾组织TGF-β1/p38MAPK信号表达,减轻足细胞在内的肾固有细胞凋亡,进而降低24h尿蛋白定量、改善肾功能、降低TG和MDA含量;升高NO、SOD含量;减轻肾脏病理损害,起到明显的糖尿病肾病肾脏保护及延缓病程进展的作用。