脉冲场凝胶电泳应用于医院感染阴沟肠杆菌的分子流行病学

目的 建立一种快速、可靠和准确的分子方法来研究感染阴沟肠杆菌分子流行病学。方法 利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）结合低频限制性内切酶技术对阴沟肠杆菌染色体DNA进行分析。细菌包埋在低熔点琼脂糖中,经染色体DNA的原位纯化后,用低频限制性内切酶XbaⅠ进行染色体DNA的原位消化。使用PFGE对限制性酶切片段分离。通过对染色体DNA限制性内切酶谱比较,确定菌株亲缘关系。结果 28株医院感染阴沟肠杆菌呈17种克隆的多克隆构成。1998年1月至6月未曾发生阴沟肠杆菌医院感染的大规模暴发流行,但在3月5日到5月15日间有2次小型的克隆传播,即A、B克隆,分别都涉及5株菌。结论 PFGE具有分辨力高、重复性好的特点,是微生物实验室调查阴沟肠杆菌分子流行病学较好的方法。     

环丙沙星耐药肠杆菌科细菌临床株qnr和aac(6')-Ⅰ b-cr基因的检测

目的 了解温州地区环丙沙星耐药肠杆菌科细菌临床株的qnr、aac(6')-Ⅰ b-cr基因的分布情况.方法 收集2005年8月-2008年4月间温州医学院附属第一医院环丙沙星耐药的肠杆菌科细菌共461株,其中大肠埃希菌370株,阴沟肠杆菌39株,克雷伯菌属细菌52株.应用PCR方法 检测qnr和aac(6')-Ⅰ b幕因,DNA测序检测qnrA、qnrB、qnrS和aac(6')-Ⅰ b-cr基因;接合传递试验方法 探讨细菌质粒介导的耐药性传递情况.结果 461株环丙沙星耐药的肠杆菌科细菌临床株中检出含qnr基因阳性菌株15株(3.25%),包括qnrA基因阳性株5株(4株阴沟肠杆菌和1株解鸟氨酸克雷伯菌)、qnrB基因阳性株4株(2株肺炎克雷伯菌和2株大肠埃希菌)、qnrS基因阳性株6株(2株肺炎克雷伯菌和4株大肠埃希菌);检出52株细菌(包括42株大肠埃希菌、4株阴沟肠杆菌和6株克雷伯菌属细菌)携带aac(6')-Ⅰ b-cr.15株qnr基因阳性的菌株同时携带aac(6')-Ⅰ b-cr,药敏结果 显示对业胺培南敏感但对多种抗生素耐药.15株qnr基因阳性的菌株中7株质粒接合传递试验成功,临床株对喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药性部分传递给了受体株.结论 qnr基因在温州地区环丙沙星耐药的肠杆菌科细菌临床株中较少见,而aac(6')-Ⅰ b-cr基因存在较普遍.     

超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究

按质粒所携带编码基因同源性的不同 ,将超广谱 β 内酰胺酶 (Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｐｅｃ ｔｒｕｍ β ｌａｃｔａｍａｓｅｓ,ＥＳＢＬｓ)分为 4类 ,即ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＴＥＭ ＳＨＶ混合型和非ＴＥＭ 非ＳＨＶ型 (包括ＰＥＲ、ＴＯＨＯ、ＣＴＸ Ｍ、ＯＸＡ型等 )。本文报告绍兴地区产ＥＳＢＬｓ细菌基因分型的初步结果。临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ＥＳＢＬｓ的细菌 42株 (其中大肠埃希菌 2 6株 ,肺炎克雷伯菌 16株 )。用ＰＣＲ进行酶基因分型。ＰＣＲ扩增引物 ,根据ＴＥＭ 1和ＳＨＶ 1编码基因序列设计 ,ＴＥＭ引物序列分别为…     

儿科患者中对碳青霉烯类不敏感肠杆菌科细菌耐药性和耐药基因的研究

目的 研究儿科临床分离的对碳青霉烯类抗生素不敏感的肠杆菌科细菌耐药性和产生碳青霉烯酶的耐药基因特征.方法 收集2008年1月至2010年12月北京儿童医院住院患儿分离出的46株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肠杆菌科细菌.使用琼脂稀释法进行药敏试验,测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)值,按照临床实验室标准化研究所(CLSI) 2011年推荐标准判断结果.使用改良Hodge试验和双纸片协同试验,进行产碳青霉烯酶的表型确证.使用PCR方法进行碳青霉烯酶相关耐药基因的检测.采用WHONET5.6软件进行数据分析.结果 46株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肠杆菌科细菌,26株为肺炎克雷伯菌,占56.5％,13株为阴沟肠杆菌,占28.3％,7株为大肠埃希菌,占15.2％.对亚胺培南和美罗培南不敏感率分别为肺炎克雷伯菌69.2％和80.8％,阴沟肠杆菌76.9％和100％,大肠埃希菌85.7％和100％.46株肠杆菌科细菌,改良Hodge试验阳性40株(87.0％),双纸片协同试验阳性41株(89.1％).IMP基因阳性38株(82.6％),其余8株均未扩增出特异性条带检测均为阴性.结论 目前儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素不敏感菌株中,肺炎克雷伯菌最多,占56.5％.肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素亚胺培南不敏感程度低于美罗培南,对碳青霉烯不敏感肠杆菌科细菌主要产生B类金属酶,均为IMP基因型.     

阴沟肠杆菌β内酰胺酶基因研究

目的了解临床分离的阴沟肠杆菌中β内酰胺酶基因存在状况。方法分离自临床44株阴沟肠杆菌,采用聚合酶链反应检测耐药基因(TEM、SHV、CTX-M-1群、OXA-1群、OXA-10群、DHA、ACT-1)。结果44株阴沟肠杆菌中TEM阳性24株(54.5%)、DHA阳性5株(11.4%)、ACT-1阳性35株(79.5%),其余基因均阴性。结论临床分离的阴沟肠杆菌TEM、DHA、ACT-1、基因携带率高。     

产AmpC酶阴沟肠杆菌耐药的基础与临床

目的 :对我院阴沟肠杆菌产AmpC酶菌株的检出率、耐药性及ampC结构基因序列进行分析 ,探讨阴沟肠杆菌产AmpC酶菌株的耐药性及临床特点。方法 :采用琼脂稀释法对我院临床标本中分离的阴沟肠杆菌进行产AmpC酶株的筛选 ,用酶粗提物头孢西丁三维试验结合PCR法检测AmpC酶 ,并测定产AmpC酶菌株对 9种抗菌药物的MIC值。对 3株高度耐药阴沟肠杆菌产AmpC酶的结构基因和 1株敏感菌行PCR扩增并对产物序列进行分析 ,测序的菌株与E .cloacaep99进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 :阴沟肠杆菌产AmpC酶株的检出率为2 4 .6 %。产A…     

阴沟肠杆菌的诊断噬菌体

以３４株阴汤肠杆菌培养物作为繁殖菌，从３份污水中分离到阴泡杆菌的噬菌体２４株。经测定其裂解谱并经５折的试制应用，在其中选出一株作为阴沟肠杆菌的诊断噬菌体。实验结果表明，Ｅｎｔ噬菌体可裂解阴沟肠杆菌培养物１８９株中的１６４株，对于肠杆菌科其它１４个属种的４１９６析培养物无一发现裂解，具有严格的种特异性。     

临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究

目的：研究我院产头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌的检出率、耐药情况厦ampC基因型。方法：收集临床分离的耐药阴沟肠杆菌15株;三维试验检测AmpC酶;NCCLS方法检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）;琼脂二倍稀释法测定MIC值;PCR扩增检测ampC基因及序列测定。结果：15株菌中8株菌（53,3％）产AmpC酶,3株菌（20．0％）产ESBLs。产AmpC酶的菌株除对亚胺培南全敏感外,对其它抗菌药不同程度耐药。5株菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100％同源,3株菌与之99％同源．2株菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的改变。结论：产AmpC酶是阴沟肠杆菌对口．内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。阴沟肠杆菌ECLC074 ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型。产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药,亚胺培南是治疗此类菌所致感染的最有效药物。     

HLA-DR4亚型及其分子三维结构模拟 分析在骨髓移植中的应用研究

目的 :建立ＨＬＡ -ＤＲ4亚型的套式ＰＣＲ -ＳＳＰ分型方法 ,为临床骨髓移植提供可靠依据 ,并寻找ＨＬＡ-ＤＲ4亚型与各种白血病之间的联系。探讨ＨＬＡ三维构象模拟分析在预测ＧＶＨＤ中的作用 ,以及寻找ＨＬＡ移植可容许抗原。方法 :盐析法提取 75例人外周血标本ＤＮＡ。建立并使用套式ＰＣＲ -ＳＳＰ分型方法。使用ＭＬＲ实验对 1例无血缘关系骨髓移植供、受体进行ＧＶＨＤ发病风险分析。通过ＩＮＴＥＲＮＥＴ进入ＥＸＰＡＣＹ -ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬＬＩＮＧ分子模拟服务器 ,对有关ＨＬＡ -ＤＲ4基因亚型进行ＨＬＡ三维结构的分析比较…     

我院耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌耐药机制与同源性分析

目的 调查耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(CRECL)中携带耐药基因类型与可移动遗传元件存在情况并对耐药菌株进行同源性分析。方法 收集2016年至2020年收集的52株临床分离的CRECL,通过PCR扩增、序列分析与多位点测序分型,确定其碳青霉烯耐药基因类型与菌株分子分型,检测菌株携带整合子、转座子、插入序列与接合质粒遗传标记基因等可移动遗传元件。结果 收集的52株CRECL共有4种ST型,分别为ST93型32株,ST90型14株,ST88型4株,ST177型2株。45株CRECL携带bla_NDM-1基因,14株携带bla_OXA-48基因,还检出有bla_KPC、bla_IMP与bla_VIM耐药基因。49株阴沟肠杆菌均检出整合酶基因IntI 1,47株阴沟肠杆菌检出插入序列ISEcp1。结论 我院CRECL主要的耐碳青霉烯酶基因为bla_NDM-1和bla_OXA-48基因,ST 93型为主要流行基因型。主要的可移动基因元件为Ⅰ类整合子和插入序列IS...     

临床阴沟肠杆菌感染分布及耐药性分析

目的了解本院2006-2009年临床分离的阴沟肠杆菌的感染分布和耐药趋势特点,为临床合理应用抗生素提供依据。方法用MicroScanWalkAway40全自动细菌分析系统对临床分离的阴沟肠杆菌进行鉴定和药敏试验,并分析结果。结果 207株阴沟肠杆菌主要分布在呼吸科及ICU;标本的主要来源为痰及咽拭子（75.36%）;药敏试验结果显示,阴沟肠杆菌对亚胺培南、阿米卡星敏感性最高,对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑啉及头孢西丁的耐药性最严重,耐药率均〉80%。结论阴沟肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药形势不容乐观,临床抗感染治疗应以分离菌株的体外抗菌药物敏感性为参考,同时注意分离菌株的流行趋势,合理选用抗生素,避免诱导性耐药的产生。     

HLA-A位点PCR-SSP基因分型和血清学分型的比较

目的：建立优化ＨＬＡ－Ａ位点ＰＣＲ－ＳＰ分型方法。方法：采用普通扩增仪和Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管对细胞系ＤＮＡ和３７个健康正常人进行基因分型,血清学检测采用标准淋巴细胞毒试验方法。结果：发现引物浓度和浓度比、ＤＮＡ的纯度及酶的选用,是影响ＨＬＡ－Ａ位点ＰＣＲ－ＳＳＰ分型准确性的重要因素。该方法对３７个标本的基因分型结果与血清学结果相符合。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ方法具有简便准确的优点,可以作为ＨＬＡ－Ａ位     

肠杆菌科细菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的研究

目的 调查我院院内肠杆菌科细菌中产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株的发生率以及ESBL的表型和基因型。方法 对1999年2月-5月临床分离的162株肠杆菌科细菌,采用美国临床实验室标准化委员会规定的ESBL表型筛选和确证试验确定ESBL的发生率;等电聚集电泳,抑制试验,接合试验确定ESBL菌株中酶的表型;质粒的提取,脉冲场凝胶电泳（PFGE）、TEM-、SHV-、CTX-M-3特异引物的PCR和测序确定ESBL的基因型。结果 11.4%（5/44）的大肠杆菌、39.5%(17/43)的肺炎克雷伯菌、6.0%（3/50）的阴沟肠杆菌和8.0%(2/25)的弗劳地枸橼酸菌产ESBL。对于这27株菌,头孢噻肟的MIC明显高于头孢他啶,除1株阴沟肠杆菌外,其它26株菌对亚胺培南敏感,大多数菌株产2-6种酶,70.3%(19/27)的菌株产生CTX-M-3型的ESBL（等电点为8.6)。这种酶能被克拉维酸抑制,其编码的耐药性能够转移至敏感株,并且对头孢噻肟的耐药高于头孢他啶,对小部分菌株用PF-GE分型发现存在多个克隆。结论 产ESBL的肠杆菌科在院内较普遍;CTX-M-3型的ESBL最为常见。     

阴沟肠杆菌的临床分布及耐药性分析

目的 分析2010至2012年广州医学院第二附属医院阴沟肠杆菌的临床分布及耐药情况.方法 收集2010年8月至2012年8月本院细菌室检测的痰、尿、脓液或创口分泌物、胆汁、血液及其他体液样本,从中分离出97株阴沟肠杆菌并经VITEK 2 Compact细菌鉴定仪鉴定.分析阴沟肠杆菌在各科的分布情况.采用K-B纸片法进行药敏试验,再用双纸片法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBL).结果 阴沟肠杆菌主要分布于呼吸科、肝胆外科和新生儿科,分别占12.4％、11.34％、2.06％;其中46株来自于痰,占47.42％,其次为尿、脓液或创口分泌物,均为12株,各占12.37％.标本中阴沟肠杆菌ESBL阳性株对亚胺培南耐药率最低为0,对头孢吡肟、丁胺卡那耐药率为14.29％、4.76％,与ESBL阴性株耐药率差异无统计学意义;对氨苄西林、头孢噻肟、氨曲南耐药率为100％、95.24％、100％,明显高于ESBL阴性株的耐药率.结论 阴沟肠杆菌多药耐药现象较为严重,应加强耐药性监测,指导临床医师合理使用抗菌药物.     

用顺序特异引物聚合酶链反应技术对HLA-B基因分型

目的采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立汉族人群ＨＬＡ－Ｂ基因分型方法。方法肾移植供受者临床样本ＤＮＡ３１９份，Ｂ基因标准系列ＤＮＡ６２份。设计合成Ｂ座位５２个特异性引物和１对阳性对照引物，组成４１个ＰＣＲ反应，建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法。一步法完成对Ｂ座位的基因分型。结果经双盲验证，并与血清学方法比较。结果所有临床样本和标准ＤＮＡ，ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型均获得成功。可准确分辨ＨＬＡ－Ｂ座位等位基因４１个，实际检出汉族人群Ｂ抗原特异性３２个。无假阳性和假阴性，４０份样本的重复率１００％，总耗时５小时。分型结果经双盲验证完全符合。与血清学分型结果比较显示：７８份血清学空白中１７例存在第二个基因，２６份血清学分型结果错误。总误差率１３．５％。结论用ＰＣＲ－ＳＳＰ技术行ＨＬＡ－Ｂ基因分型，分辨率高、特异性强、重复性好、相对简捷快速，分型结果较血清学方法更加精确可靠，适合于临床应用。     

脉冲场凝胶电泳分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的探索一种准确、快速、可靠的分子生物学分型方法，研究耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的流行病学。方法建立脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）的分子生物学分型方法。将细菌包埋于琼脂块中，原位溶解细菌，ＳｍａⅠ消化染色体ＤＮＡ，经脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）分离，比较染色体限制性内切酶图谱，确定菌株的亲缘关系。结果３８株ＭＲＳＡ的ＰＦＧＥ谱分１０组（Ａ～Ｊ），以Ａ型为主，Ａ型又有Ａ１～Ａ４四个亚型。１９９５年１１月～１９９６年３月发生了Ａ１亚型株暴发流行，从１８位住院病人共分离到２２株。暴发流行株在住院病人、各病房及各医院之间进行传播。结论对ＭＲＳＡ的流行病学进行研究，ＰＦＧＥ是一种准确、可靠、重复性好的分子生物学分型方法。     

同时产ArmA型16S rRNA甲基化酶及KPC-2型β-内酰胺酶泛耐药阴沟肠杆菌的研究

目的 探讨上海交通大学医学院附属瑞金医院分离的5株泛耐药阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶及16S rRNA甲基化酶的情况及两者之间的相关性.方法 用E test法检测5株泛耐药阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值.PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、mtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA,β-内酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、PER-1、VEB-1.鸟枪克隆法克隆碳青霉烯酶基因,并对克隆片段进行测序.质粒接合试验验证碳青霉烯酶基因及16S rRNA甲基化酶基因是否具有转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)法对5株菌进行分子分型.等电聚焦电泳法检测β-内酰胺酶等电点.Southern杂交法对耐药决定因子进行定位.结果 5株阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值均＞32 mg/L.克隆的碳青霉稀酶基因为blaKPC-2,酶编码基因上游为一转座酶基因,两侧为复制靶位,下游为ISKpn6的插入序列,该序列包括一个重复序列和tnpA转座子,酶编码基因位于54.2 kb的一个非接合性大质粒上.等电聚焦电泳显示5株菌均产4种β-内酰胺酶(TEM-1,pI5.4;KPC-2,pI6.7;SHV-12,pI8.2;CTX-M-14,pI8.4).16S rRNA甲基化酶基因位于接合性质粒上,而blaKPC-2基因则位于非接合性质粒上,5株菌PFGE型别一致.结论 5株泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药由产碳青霉烯酶KPC-2所介导.blaKPC-2与armA型16S rRNA甲基化酶基因由两条不同的质粒编码,不存在相关性.临床医院应加强监控,以防止交叉感染.     

广东汉族人类风湿关节炎易感性与HLA—DRB1基因相 …

探讨ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因与类风湿关节炎相关性。方法 采用ＰＣＲ－ＳＳＰ方法对４７例广东汉族人ＲＡ患者进行ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因分型，并与相应人群健康者１０２例结果比较。结果 ＨＬＡ－ＤＲ１基因在ＲＡ组显著增高，ＤＲ１６在ＲＡ组也高于正常；而ＥＲ９基因在ＲＡ组显著减少。     

铜绿假单胞菌随机扩增多态性DNA指纹法基因分型研究

建立了铜绿假单胞菌（ＰＡ）随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）指纹图基因分型方法，并应用于流行病学相关或不相关的７５个ＰＡ菌株的基因分型。分型率为１００％。３２株新生儿暴发感染菌株，可分成４个血清型和５个ＲＡＰＤ谱型，其中２５株属于同一谱型。在８例患者的垂直追踪菌株中，除有１例其第１和第３个分离株的血清型和ＲＡＰＤ谱型均相同，但与第２个分离株的血清型和ＲＡＰＤ谱型不同外，其余７例前后菌株的谱型相同。１３株散发菌株可分成３个血清型和１０个ＲＡＰＤ谱型；１２株流行病学无关菌株的ＲＡＰＤ谱型均不相同。本研究结果表明，ＲＡＰＤ指纹图基因分型法具有分型率高、分辨力强、比较快速简便等优点，并且不需要已知核酸序列，是在分子水平上对微生物感染的病原学、发病机理及流行病学研究的较理想的方法。     

用PCR-SSP分析HLA-B位点血清学分型困难标本

对血清学ＨＬＡ－Ｂ位点分型困难标本用ＰＣＲ－ＳＳＰ方法分析,并寻找血清分型效果不佳原因。方法：用本室建立的ＰＣＲ－ＳＳＰ方法对１００株标准细胞及９１份血清学分型困难标本分别作ＨＬＡ－Ｂ位点分析,前者为作ＰＣＲ－ＳＳＰ方法的参考对照品。结果：１０００株标准细胞分析结果与已知结果一致;９１例疑问标本均顺利地区ＰＣＲ－ＳＳＰ分型,结果共有７０种等位基因格局,其中３６种与血学 同,占５２％,ＰＣＲ－ＳＳＰ