β-1，4半乳糖基转移酶-Ⅰ对雪旺氏细胞增殖的影响

目的：探讨周围神经雪旺氏细胞表达β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1，4-galactosyltransferase Ⅰ，β-1，4-GalT-Ⅰ)对其增殖的影响。方法：构建正、反义β-1，4-GalT-Ⅰ表达质粒，将其转染到分离培养的雪旺氏细胞中；运用细胞计数分析转染细胞倍增时间、培养细胞3H-TdR掺入检测转染细胞增殖程度；应用流式细胞仪分析转染细胞的细胞周期变化。结果：转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后雪旺氏细胞的增殖受到抑制，且这种抑制作用随转染浓度增大而增强。而转染反义β-1，4-GalT-Ⅰ有相反的作用。转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后，雪旺氏细胞周期主要被阻滞在G1／G0期。结论：β-1，4-GalT-Ⅰ对雪旺氏细胞的增殖有抑制作用，可能在周围神经雪旺氏细胞的有序增殖过程中发挥重要作用。     

DOX-GA3对βG转染人肾癌GRC-1细胞的体外杀伤作用

目的：建立高表达β-葡萄糖醛酸苷酶（SG）基因的肾癌模型,并观察SG前体药葡萄糖醛酸化阿霉素（DOX-GA3）对SG转染人肾癌GRC-1细胞的体外杀伤作用．方法：利用阳离子脂质体将已构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）转入肾癌细胞株GRC-1,用基因组PCR扩增,免疫荧光,免疫组化检测鉴定其转录和表达水平,分别用MTF及细胞计数法检测SG阳性细胞对DOX-GA3的体外敏感性和旁观者效应．结果：经G418筛选后的阳性细胞克隆,在DNA和蛋白水平证实了转染细胞内有SG基因高表达,100μmol／LDOX-GA3作用于亲本细胞3d,生存率为82％,但可杀死全部转染细胞,IC50GRC-1／SG为1．24μmol／L,而IC50GRC-1为100μmol／L以上,将转染细胞和亲本细胞以不同比例混合时,转染细胞占20％,有80％的细胞被杀死．结论：建立了稳定的SG基因高表达的肾癌模型．DOX-GA3对转染细胞有明显的杀伤作用,随时间延长和剂量增加作用增强,并显示较强的旁观者效应．     

整合素β3亚基真核表达载体的构建及αvβ3的表达

目的：构建人整合素β3亚基真核表达载体，并探讨如何使人整合素αvβ3在CHO细胞表面有效表达．方法：构建编码人整合素β3真核表达载体pcDNA3．1-β3；将其与编码人整合素αv亚基真核表达载体分别及共转染至中国仓鼠卵巢(China hamster ovary，CHO)细胞中进行表达；采用间接免疫荧光法(IFA)检测外源基因的表达．结果：共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达；pcDNA3．1-β3单独转染组β3亚基细胞膜表达较共转染组弱；而pcDNA3-αv单独转染组则未见有效的细胞膜表达．结论：人整合素αvβ3在CH0细胞表面的有效表达需要2个亚基共同参与。     

p53基因治疗与放疗联合作用对卵巢癌细胞的杀伤效果

目的：探讨外源性p53基因转染与放疗联合作用对人卵巢癌细胞的杀伤效果。方法：用脂质体介导的转染技术，将人野生型p53基因的真核表达载体及不含p53基因的空载体分别导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中，经G418筛选，Northern blot及Western blot鉴定后，观察X射线照射对其集落形成的影响。结果：外源性p53基因在转染细胞中有效表达。经X射线照射后，转染p53基因组的SKOV-3细胞的集落形成数与转染空载体组及未转染的SKOV-3细胞组相比，明显降低。结论：外源性p53基因能增加卵巢癌细胞对放射线的敏感性，2者联合作用能更有效地杀灭肿瘤细胞。     

HYAL2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术抑制人卵巢癌SKOV3细胞株HYAL2基因的表达,探讨siRNA-HYAL2对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭能力的影响.方法：将靶向HYAL2的siRNA及对照分别转染人卵巢癌SKOV3细胞株,RT-PCR测定HYAL2基因mRNA表达情况,MTT法检测SKOV3细胞增殖,FCM检测细胞周期变化,构建Transwell小室体外侵袭模型观察其对细胞侵袭能力的影响.结果：转染siRNA-HYAL248 h后HYAL2基因mRNA表达水平明显降低,细胞存活率下降（P〈0.05）,S期细胞百分比降低、G0/G1期细胞百分比升高（P〈0.05）;转染24 h后平均穿膜细胞数减少（P〈0.05）.结论：siRNA-HYAL2能特异性抑制HYAL2的mRNA表达水平,HYAL2基因沉默后,卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭能力降低,HYAL基因可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

正、反义β-1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的转染与鉴定

目的：构建β-1，4-半乳糖基转移酶-V(β-1，4-GalTV)正、反义表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中，为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的生物学意义提供研究基础。方法：构建β-1，4-GalTV表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中；用Western印迹和Northern印迹鉴定转染情况。结果：通过酶切鉴定和测序分析，实验成功构建β-1，4-GalTV表达质粒。将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中，经鉴定表明，转染的正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1，4-GalTV表达量，而转染反义质粒则能降低细胞中β-1，4-GalTV表达量。结论：正、反义β-1，4-GalTV表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达，对分析胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的意义如对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响提供了研究基础。     

NDRG2对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：观察NDRG2（N—myc downstream regulated gene 2）对于乳腺癌细胞系增殖的影响．方法：采用脂质体转染法将NDRG2基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3,经G418筛选后获得稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag及仅转染载体的SK—BR-3／pcDNA3．1（＋）．应用Western Blot检测NDRG2在转染细胞中的表达;应用平板克隆形成试验、MTT、流式细胞仪检测转染前后细胞增殖能力的差异．结果：成功建立了稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag;NDRG2的高表达导致了乳腺癌细胞系增殖能力减弱（P〈0．01）：细朐周期阳滞存G0／G1期．结论：存乳腺痛细胞系SK—BR-3中,过表达NDRG2可有效抑制细胞增殖并导致细胞周期的阻滞．     

稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立

目的：建立稳定表达缺失型DNA聚合酶β（polβ）的细胞系。方法：将已构建的缺失型polβ的真核表达载体pcDNA3．1-polβ用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定细胞缺失型polβmRNA的表达。结果与结论：成功转染和筛选出表达缺失型polβ细胞株CHO—polβ，建立了稳定表达缺失型polβ的CHO细胞株。     

βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中的差异表达及其意义

目的：测定转化生长因子β（TGF-β）诱导分子βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中的表达情况。方法：培养人肝癌细胞T7721（转染并稳定高表达HAb18G／CD147）、7721（未转染HAb18G／CD147）、人肝细胞癌细胞系（HHCC）和正常人张氏肝细胞QZG，提取总RNA，设计合成特异性引物，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，检测βig-h3 mRNA的差异表达情况。结果：逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）结果显示，TGF-β诱导分子βjg-h3的mRNA在人肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞（P〈0．01），其在人肝癌细胞系中的表达水平依次为HHCC〉T7721〉7721，在正常肝细胞QZG中表达水平最低。结论：证明了βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中高表达，为进一步探讨βjg-h3在肝癌细胞黏附和转移过程中的作用机制奠定了基础。     

稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3 T3细胞系的建立及其生长特性

目的：建立稳定表达野生型及突变型DNA聚合酶β（polβ）的NIH3T3细胞系。方法：用脂质体转染法分别将野生型和突变型polβ真核表达载体pcDNA3．1-PW和pcDNA3．1-PM3转染入NIH3T3细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系。用RT—PCR、免疫印迹法检测转染细胞polβmRNA和POLB蛋白的表达水平．MTT法测转染细胞生长曲线,免疫组化法测增殖细胞核抗原（PCNA）,并用流式细胞仪测细胞周期。结果与结论：成功建立了稳定表达野生型及突变型polβ的NIH3T3细胞系。野生型polβ对NIH3T3细胞生长无明显影响,突变型polβ则使NIH3T3细胞生长速度加快,细胞周期发生改变,细胞多被阻滞在S期。     

人脐带间充质干细胞的人转化生长因子β3基因稳定表达系统的构建

目的：探讨构建人脐带间充质干细胞（huMSCs）的人转化生长因子（hTGF）β3基因稳定表达系统的可行性,为进一步探讨创面治疗的研究打下基础。方法：用组织贴壁法原代培养huMSCs,流式细胞术（FCM）鉴定细胞表面抗原CD29、34、44、45和80,用脂质体介导的转染技术将人pcDNA3.1（-）/TGF-β3重组质粒转染进入huMSCs,并用G418进行筛选得到单克隆细胞,扩增后得到稳定表达人TGF-β3细胞株,逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学技术检测转染前、后及筛选前、后细胞内TGF-β3基因表达,再次采用FCM检测细胞表面抗原表达变化,最后Western blot检测稳定表达组及未转染huMSCs的TGF-β3蛋白表达。结果：原代培养的HuMSCs中约70%的细胞表达表面抗原CD29、44,而绝大部分不表达CD34、45和80,原代培养的细胞符合huMSCs特性。免疫细胞化学染色显示瞬时转染率为（10.0±0.2）%,稳定转染率（85.0±0.7）%（P〈0.05）,RT-PCR、Western blot显示转染并通过G418筛选的huMSCs高表达hTGF-β3,转染hTGF-β3基因的huMSCs其表面抗原与未转染前保持一致。结论：HuMSCs的hTGF-β3基因稳定表达系统构建成功,转染hTGF-β3基因的huMSCs体外培养条件下仍保持干细胞特性。     

α 1,2-岩藻糖转移酶基因转染对卵巢癌细胞RMG-1裸鼠体内致瘤性及血管生成因子表达的影响

目的 比较α1,2岩藻糖转移酶(α1,2-FT)基因转染前后卵巢癌细胞株RMG-Ⅰ的裸鼠体内致瘤性及移植瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及碱性成纤维生长因子(b-FGF)表达的变化.方法 我们在前期工作中利用基因转染技术将α1,2-FT基因转入人卵巢癌细胞株RMG-Ⅰ,建立了α1,2-FT及Lewis y高表达细胞株RMG-I-H.本实验将转染前后细胞种植裸鼠皮下建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,观察两组肿瘤生长情况.5周后处死动物,测量移植瘤质量,免疫组织化学方法检测肿瘤组织VEGF、TGF-β1及b-FGF的表达.结果 两组裸鼠均有皮下荷瘤形成,但转染组的成瘤时间(5.2±0.8d)早于未转染组(8.8±1.3d),且转染组的瘤质量和体积与未转染组相比亦明显增加(P<0.05).转染组裸鼠移植瘤组织VEGF、TGF-β1及b-FGF的表达均明显高于未转染组(P均<0.05).结论 α1,2-FT基因转染能增强卵巢癌细胞RMG-Ⅰ的体内致瘤性,上调裸鼠移植瘤组织VEGF、TGF-β1及b-FGF的表达.提示α1,2-FT及Lewis y抗原参与血管生成,其高表达在促进血管生成中可能发挥重要作用.     

稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定

目的:构建人CXCR4真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果.方法:从人卵巢癌组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CXCR4的基因编码序列,将序列定向克隆至真核表达载体pReceiver-M02,经酶切和测序鉴定后用脂质体介导的转染技术将质粒pReceiver-M02-CXCR4导入不表达CXCR4蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系.分别采用RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学方法检测稳定转染细胞株CXCR4 mRNA和蛋白的表达.结果:得到了抗G418阳性细胞克隆;RT-PCR的产物约为304 bp;Western blot可见一清晰的蛋白条带,与CXCR4的蛋白分子质量相符合.免疫细胞化学结果显示,转染质粒的SKOV3细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒.结论:成功建市稳定表达趋化因子受体CXCR4的卵巢癌细胞株,为CXCR4在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台.     

增强型绿荧光蛋白基因修饰永生化大鼠肝细胞的实验研究

目的：建立携带示踪标记的永生化大鼠肝细胞系。方法：用脂质体转染法将增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因转入永生化大鼠肝细胞中。结果：转染3d后，在荧光显微镜下观察，对照组肝细胞不发荧光；实验组肝细胞发绿荧光，转染率为41%，经G418筛选后得到稳定表达的肝细胞。结论：应用基因转染技术将EGFP基因转入永生化大鼠肝细胞中并获得稳定表达。     

重组凋亡素真核表达载体诱导人卵巢癌细胞凋亡

目的 观察凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoCl中诱导凋亡的情况。方法 用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ分别双酶切pMD18-CAVP3和pcDNA3．1（＋），分别回收365bp和5．0kb大小的片断，然后常规行连接反应，构建重组凋亡素真核表达栽体pcDNA3．1-VP3。采用Lipofectamine^TM 2000介导的基因转染法，在体外将pcDNA3．1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoCl中，RT—PCR检测凋亡素在细胞中的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 酶切鉴定及测序结果表明重组凋亡素真核表达载体pcDNA3．1-VP3构建成功。RT—PCR证实VP3基因在COCl中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3．1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0．01）。结论 凋亡素可有效诱导卵巢癌细胞COCl凋亡。     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的：鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达，为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件。方法：利用脂质体Fugene6将GFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞，RT-PCR、ELISA检测h TGFβ1基因的表达，并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性。结果：质粒转染3T3细胞后，hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且分泌表达的hT GFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长。结论：重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

野生型p53,GM-CSF和B7-1基因转移对卵巢癌细胞系SKOV-3增生的影响

目的研究人野生型p53、GM-CSF和协同刺激因子B7-1基因共转染对卵巢癌细胞增生的影响。方法以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体转染卵巢癌细胞系SKOV-3,荧光显微镜观察,流式细胞计数计算转染效率;以携带野生型p53、GM-CSF和B7-1基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,RT-PCR检测目的基因表达,观察转染前后细胞形态的变化,绘制细胞生长曲线。结果当腺病毒的感染强度达到400 pfu/细胞时,转染率可达到81%;以携带目的基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,能检测到相应基因表达;转染后SKOV-3细胞形态发生改变,增生减缓。结论腺病毒载体能介导目的基因转入卵巢癌细胞,并有效表达;人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因共转染能减缓卵巢癌细胞的增生。     

Fas基因在卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的 :检测Fas基因表达并观察转染Fas基因对卵巢癌细胞凋亡的影响 ,探讨其在卵巢癌发生、发展中的作用。方法 :经流式细胞术、RT PCR方法检测 6种卵巢癌细胞Fas的表达水平。构建pcDNA3 Fas真核表达载体 ,经脂质体转染细胞 ,通过流式细胞仪检测Fas基因表达变化。应用PI染色经流式细胞术检测观察转染Fas基因对3AO细胞凋亡的影响。结果 :6种卵巢癌细胞均表达Fas,均属中低表达。经 pcDNA3 Fas真核表达载体转染的卵巢癌细胞Fas基因表达及对Fas单抗诱导凋亡的敏感性均有不同程度提高。结论 :Fas基因低表达及对Fas介导凋亡的抵抗可能与卵巢癌发生、发展有关 ;转染Fas基因可提高Fas基因表达 ,可促进卵巢癌细胞凋亡     

人类14-3-3β真核表达系统的构建

目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达.方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达.结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础.     

人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。