成纤维细胞在聚羟基丁酸酯表面黏附与种植研究

可降解高分子聚合物广泛应用于组织工程,其表面的黏附特性影响细胞的种植与生长。我们研究了成纤维细胞系NIH3T3在可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）表面的黏附和生长。应用线性变剪切流槽研究NIH3T3细胞在材料表面的黏附力学特性,结果表明,由于在PHB表面的临界脱离剪应力较低,高密度接种时间细胞趋于聚集;在经多聚赖氨酸衣被的表面临界脱离剪应力提高,细胞铺展生长。对三维PHB多孔支架种植细胞实验表明,在PHB材料表面进行多聚赖氨酸衣被,可以有效地提高细胞种植效率。     

几种生物材料种植人成纤维细胞的比较

目的 通过人成纤维细胞种植，比较几种形式的聚酯材料，以及脱细胞生物组织基质的细胞亲和性，为组织工程血管及瓣膜研究选择支架材料。方法 ①聚氨酯(PU)、第3代聚烷酸酯[PHAs，分子表达式为p(3HB—co—3HH)]、PHAs／PU共混物分别涂在载波片上制成薄膜，将人成纤维细胞种植其上，培养3天。HE染色后于显微镜下每片取相同4点计数，得出平均值。②分别在PHAs／PU片、脱细胞牛心包片、脱细胞猪肺动脉瓣(简称猪瓣)种植人成纤维细胞，PHAs／PU片培养7天，后两者培养3天。用HE染色、扫描电镜分别观察细胞生长情况。结果 ①3组薄膜片上细胞平均数分别为(PU)196、(PHAs)124、(PHAs／PU)160。②扫描电镜显示PHAs／PU片表面约50％有细胞覆盖，细胞聚合成粗大束带状结构，牛心包表面紧密覆盖着厚实的鳞甲状细胞结合体，猪瓣瓣叶表面覆盖紧密联结的板状细胞结合体。③HE染色显示PHAs／PU片和牛心包片、猪瓣瓣叶单侧有联结较完整的细胞层覆盖，局部有3—4层重叠而成，牛心包片和猪瓣瓣叶上细胞与基质联结紧密。结论 ①PHAs混入PU后细胞亲和性显著提高，适宜作血管及补片支架材料；②脱细胞牛心包组织和猪瓣细胞亲和性明显好于合成材料，适合作血管、补片及带瓣通道组织工程支架。     

异种(猪)脱细胞真皮基质粉对表皮细胞和成纤维细胞的促进作用

目的观察冷冻研磨获得的脱细胞真皮基质粉(ADMP)生物学性状,探索高纯度且保留生物活性的异种(猪)ADMP对表皮细胞和成纤维细胞生长的支持及在皮肤创伤修复中的应用。 方法选取幼龄长白猪背部皮肤,经生物酶法脱细胞、冷冻干燥后经过不同冷冻研磨程序得到异种(猪)ADMP,再由⁶⁰钴辐照获得无菌异种(猪)ADMP;通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察异种(猪)ADMP颗粒大小及胶原形态,确定适合应用的研磨程序;通过MTT法检测HaCaT细胞和BJ人皮肤成纤维细胞在不同浓度异种(猪)ADMP包被下的黏附作用,确定异种(猪)ADMP实现细胞最大黏附的浓度范围;DMEM培养液基添加异种(猪)ADMP为实验组,单纯DMEM培养液基为对照组,使用实时细胞分析技术分析BJ人皮肤成纤维细胞迁移指数,验证异种(猪)ADMP对成纤维细胞的促迁移作用;原代表皮细胞接种在异种(猪)ADMP培养液8 d,绘制增殖曲线,检测异种(猪)ADMP对原代表皮细胞的促增殖作用,同时免疫荧光检测原代表皮细胞表面成熟与分化蛋白的表达。对数据进行Student′s t－检验。 结果1、2、3、5、7、10次循环研磨获得异种(猪)ADMP,肉眼可见全部为白色、无块状,其中1、2、3次循环呈较粗颗粒;5、7、10次循环呈现集中均匀趋势,粒径分布在0～12 μm之间。其中5次循环粒径(13.00±2.10) μm与7次循环[(6.00±0.96) μm比较,差异有统计学意义(t＝6.093,P＝0.0002)。异种(猪)ADMP透射电子显微镜下发现,不同循环次数获得的异种(猪)ADMP均能保留大量胶原分子。BJ人成纤维细胞和HaCaT细胞随包被浓度的增加,细胞黏附作用不断增强,浓度高于750 μg/cm²,无明显变化。实时细胞分析技术检测BJ人皮肤成纤维细胞在DMEM培养液基对照组培养液72 h后的迁移指数为1.21±0.10,而异种(猪)ADMP培养液基试验组的迁移指数为3.66±0.11,两组比较差异有统计学意义(t＝22.24,P＝0.002)。在异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞形态统一增殖迅速,对照组出现一定比例的分化细胞,试验组与对照组第5天细胞数分别为(4.11±0.28)×10⁵、(1.10±0.12)×10⁵个,两组比较差异有统计学意义(t＝13.51,P＝0.005);第8天细胞数分别为(5.00±0.48)×10⁵、(3.05±0.30)×10⁵个,两组比较差异有统计学意义(t＝4.87,P＝0.039),增殖曲线显示试验组在接种即日培养液至第5天,一直处于指数增长期。荧光染色中异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞E-cad全部表达,少量表达角蛋白10,整合素α6几乎全部强阳性,角蛋白14全部表达并有部分强阳性,Ki-67抗原表达率高。 结论通过生物酶解和冷冻研磨获得的异种(猪)ADMP对参与皮肤创伤修复最重要的表皮细胞和成纤维细胞,具有促进其增殖和迁移的作用,未来可进一步应用于皮肤创伤修复。     

心脏瓣膜组织工程支架的制备及细胞种植

为了探讨心脏瓣膜组织工程支架的制备及细胞种植 ,我们将新鲜猪心瓣膜用胰蛋白酶及 DNA酶消化去除细胞 ,光镜和电镜观察其结构 ,并将人脐静脉内皮细胞株、猪颈动脉内皮细胞和狗肌成纤维细胞滴种在脱细胞猪心瓣膜上 ,HE和免疫组化染色观察。结果显示胰蛋白酶联合 DNA酶消化去除了所有细胞 ,而瓣膜的三维结构保持完好。种植的人内皮细胞几乎完全覆盖了瓣膜的表面 ,猪内皮细胞在瓣膜上呈斑块状生长 ,狗肌成纤维细胞不但生长于瓣膜表面 ,且渗透到基质内部生长。这表明 ,胰蛋白酶联合 DNA酶消化是一种较为理想的猪瓣膜脱细胞方法 ;人和猪血管内皮细胞及狗肌成纤维细胞均能在猪瓣膜支架上较好地黏附和生长。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用

背景：碱性成纤维细胞生长因子是具有多功能的细胞生长因子,对来源于中胚层及神经外胚层的细胞有明显的促进增殖作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用。 方法：将第5代人牙周膜细胞,以1×108 L-1的浓度分别接种到96孔板,随机分成4组,分别加入含0,1,10,100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。在第1,3,5,7天测定细胞的增殖情况,在第1,7天检测碱性磷酸酶活性。 结果与结论：4组之间人牙周膜细胞增殖情况的差异有显著性意义(F=6.586,P=0.024),随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增大,吸光度值均增大,其中100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组的吸光度值均大于其他组(P < 0.05);碱性成纤维细胞生长因子各组的碱性磷酸酶活性均低于对照组(P=0.000),浓度越大,活性越低(P < 0.05)。结果显示碱性成纤维细胞生长因子在1-100 μg/L范围内质量浓度越高,促进人牙周膜细胞增殖和抑制碱性磷酸酶活性的作用越强。     

新型海藻酸钠组织工程支架材料与人成纤维细胞的相容性

目的 利用N-乙基.N'-[(3-二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为催化剂-乙二胺作为交联剂制备新型海藻酸钠组织工程支架材料(简称材料)并测试其细胞相容性.方法 以体外培养的人成纤维细胞作为对象.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测材料浸渍液对细胞增殖情况的影响,光镜下观察材料浸渍液中细胞的生长状况.将人成纤维细胞悬液接种于材料表面,制备人成纤维细胞-材料复合物,扫描电镜下观察培养7 d的复合物表面细胞的黏附和生长状态,评价材料的细胞相容性.结果 材料浸渍液作用1、2,4、7 d后人成纤维细胞的相对增殖率(RGR)分别为98.00%、104.10%、110.80%、93.17%,毒性均为0级或1级.倒置显微镜观察人成纤维细胞在材料浸渍液中生长形态良好.扫描电镜下培养7 d的人成纤维细胞-材料复合物表面人成纤维细胞能很好的与材料黏附,材料表面细胞均生长旺盛形成许多伪足状突起,并分泌产生细胞基质.结论 新型海藻酸钠组织工程支架材料与人成纤维细胞的相容性良好,为其作为细胞生长支持物和进一步的医学应用提供了实验依据.     

人胚肺成纤维细胞与肺腺癌细胞共同培养时增殖率的变化

用一种新的细胞培养技术，选用人肺腺癌细胞及人胚肺成纤维细胞，将两者这一定顺序定位培养在同一容器内，用原位计数法分别测定两种细胞在１２，３６，６０，８４小时培养的细胞数法计算两种在不同时相的增殖率，观察人肺腺癌细胞和成纤维细胞的相互影响。     

人肝癌细胞与成纤维细胞共育时细胞增殖率的动态变化

本文采用定位细胞培养技术，将人肝癌细胞和成纤维细胞有序地排列在同一容器内，用原位计数法分别测定两种细胞在培养１２、３６、６０、８４ｈ的细胞数，计算两种细胞在不同时相的增殖率，观察人肝癌细胞和成纤维细胞的相互影响。结果显示：肝癌细胞在１２～３６ｈ、３６～６０ｈ期间可刺激成纤维细胞的生长；在６０～８４ｈ则抑制成纤维细胞的生长。成纤维细胞在１２～３６ｈ刺激肝癌细胞的生长，在６０～８４ｈ则对肝癌细胞的生长起抑制作用。表明两种细胞之间存在着相互调控的关系     

骨组织工程中人骨髓间质干细胞动态种植和静态种植的比较研究

分别采用动态种植(旋转烧瓶法)和静态种植方法种植人骨髓间质干细胞,于种植后的两周内测定细胞-载体构件中DNA含量;利用组织学光镜和扫描电镜观察细胞的分布情况;运用荧光标记RT-PCR技术测定相关成骨基因的表达。构件中DNA含量测定表明,对于静态种植,当初始种植密度为每载体400×103(8.9×104/mm3)时,DNA的含量达到最高;在此基础上提高初始种植密度,并不能进一步提高构件DNA含量。光镜和扫描电镜观察可见动态种植后人骨髓间质干细胞在载体中的分布相对均匀,静态种植后细胞在载体中出现聚集现象;荧光标记RT-PCR证明,体外构件培养两周后,动态种植后的细胞-载体构件中有较多的成骨基因表达。提示人骨髓间质干细胞的静态种植效率较低;动态种植是一种优于静态种植的可行方法。     

人脱细胞羊膜与体外培养大鼠血管平滑肌细胞的生物相容性

目的了解人脱细胞羊膜(HAM)的细胞相容性;观察以HAM为生长载体,复合大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)构筑组织工程膀胱的可能性。方法用物理和酶消化方法处理人羊膜,将大鼠VSMCs与HAM进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。将20只大鼠随机分为两组后行半膀胱切除术,实验组10只行半膀胱切除后用复合大鼠VSMCs的HAM进行修补,另外10只以单纯的HAM修补。分别于术后2、4、8周测定膀胱容量并取膀胱进行组织学观察。结果经物理和酶处理的HAM纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;VSMCs在HAM上可黏附生长,并能长入材料的孔隙内。应用HAM行大鼠膀胱重建术后,实验组与对照组膀胱最大容量(Volmax)比较无显著性差异。组织学观察显示,2周时HAM即已吸收降解,膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成,炎性反应明显;实验组膀胱平滑肌比对照组厚且规则。4周和8周时实验组和对照组膀胱均与正常膀胱组织无明显区别。结论HAM的细胞相容性良好,不影响VSMCs的形态,作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速,可用做组织工程膀胱的支架材料进一步研究。     

不同厚度脱细胞猪皮作为微粒皮移植覆盖物治疗大面积烧伤的临床观察

目的观察不同厚度脱细胞猪皮作为自体微粒皮移植覆盖物治疗大面积烧伤的效果。方法随机选择15例大面积深度烧伤患者,其中男性12例,女性3例,年龄35～57岁。烧伤后3-7d行大面积切痂,7例覆盖中厚型脱细胞猪皮,8例覆盖全厚型脱细胞猪皮,将自体微粒皮涂抹于创面,植皮区与供皮区面积比均约为10：1,常规加压包扎。观察猪皮排异变化、微粒皮成活情况及愈后皮肤弹性及外观。结果术后5d脱细胞猪皮与手术创面粘贴良好;中厚型脱细胞猪皮于术后10d、全厚型脱细胞猪皮于术后2周左右脱水干燥;中厚型脱细胞猪皮于术后3周、全厚型脱细胞猪皮于术后1个月左右逐渐分批脱落：脱落后全厚型脱细胞猪皮组创面愈合率达90．3％±2．7％,明显优于中厚型脱细胞猪皮组的68．2％±29％（P〈0.05）：创面愈合后全厚型脱细胞猪皮组瘢痕较轻,外观及弹性优于中厚型脱细胞猪皮组。结论脱细胞猪皮替代异体皮作为微粒皮移植覆盖物．全厚型脱细胞猪皮优于中厚型脱细胞猪皮。     

异种（猪）去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的临床应用

目的观察异种（猪）去细胞真皮基质修复深度烧伤创面的临床效果。方法临床选取40例深度烧伤患者，同一患者不同创面分别使用异种（猪）去细胞真皮基质＋自体刃厚皮（复合皮组）和自体刃厚皮（对照组）覆盖切痂创面，术后定期行创面愈合率和收缩率比较，同时行组织学观察。结果复合皮组创面愈合良好，两组创面愈合率比较无统计学差异；但复合皮组皮肤弹性较好，收缩率显著低于对照组；组织学观察复合皮组真皮胶原纤维排列有序，基底膜结构完整。结论异种（猪）去细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植于深度烧伤切痂创面，可改善创面愈合质量。     

不同强度永磁磁场对成纤维细胞的生物学活性影响研究

目的以磁源空间磁场定量计算为依据,研究正常培养条件下与缺氧培养条件下不同强度永磁磁场对人皮肤成纤维细胞的影响。方法选用人皮肤成纤维细胞,以5×104/mL密度每孔100μL种于96孔板。磁源N面中心实测磁感应强度分别为3.4、5.6、13.8、27.8、52.6、107.0、178.9、292.2 mT的8组磁源,前6组(钐钴合金)尺寸分别为Φ8.0 mm×2.0 mm,后两组(钕铁硼)尺寸分别为Φ8.0 mm×1.5 mm、Φ8.0 mm×2.5 mm,均轴向充磁,即为A、B、C、D、E、F、G、H组。将8组磁场分别作用于正常培养条件下与缺氧培养条件下的人皮肤成纤维细胞,并设对照组(加磁组与非加磁组),3 d后用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别检测细胞活力,做统计学分析。结果两种培养条件下8组不同强度的加磁组人皮肤成纤维细胞的MTT数值与非加磁组的对照组相比较均有升高,正常培养中磁场强度为B、C、D、E、F、G、H组与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),且随着磁场强度的增加活性值越高;缺氧培养中磁场强度为G、H组与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实验中选取的永磁磁场对于人皮肤成纤维细胞有增殖和降低损伤的作用。     

Inhibition of fibroblast cell adhesion on substrate by coating with 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymers

Fibroblast adhesion and growth behavior were examined on various polymers coated on a poly(ethylene telephthalate) (PET) substrate. The polymers are poly[2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC)-co-n-butyl methacrylate copolymer (PMB)s with different MPC unit compositions, and poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Surface analysis by dynamic contact angle measurement revealed that the mobility of the polymer chain on the PET substrate depended on the MPC unit composition, but there was no significant difference between the PMBs with 3-10 mol% MPC units and poly(HEMA). Fibronectin adsorption on the polymer surface from a cell culture medium was determined by immunoassay. The adsorbed fibronection was evenly distrubuted in every polymer, however, the amount was reduced with an increase in the MPC unit composition in the PMB. This result suggested that the MPC unit could weaken the interaction between the polymer surface and proteins. When fibroblast L-929 cells, were cultured on the polymers, the cells adhered and the number of cells increased on not only the hydrophobic poly(BMA) but also on the hydrophilic poly(HEMA). However, the number of cells that adhered on the PMB surface decreased with an increase in the MPC unit composition. This was a result of the fibronectin adsorption behavior. Thus, it could be concluded that since the PMB could suppress cell adhesion proteins e.g. fibronectin, the PMB showed excellent cell adhesive resistance properties.     

应用CelliGen细胞罐高密度培养抗人B血型杂交瘤细胞条件的研究

应用CelliGen细胞培养罐,培养抗人B血型杂交瘤细胞,获得了细胞密度超过10~7/ml,产物IgM 2g/L以上,特异性血凝效价达到2~(13)～2~(15)。培养条件50～80r/min、pH7.2、溶解氧(DO)30％～50％,高密度时维持DO2％～10％是必要的,4种气体混合流量为0.2LPM,高密度时要增加氧气供应,细胞密度达到1.6×10~6/ml时开始灌注,随细胞密度增加,灌注量亦增加,每天补充新培养液由800ml逐渐增加到3000ml。13B1杂交瘤细胞生长代谢与葡萄糖、乳酸有关,与氨代谢无关。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染优化脐带间充质干细胞的培养

背景：目前多采取重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染的方法,将外源性碱性成纤维细胞生长因子基因转入脐带间充质干细胞内并持续表达,调控细胞增殖及定向分化,取得高效持久的治疗作用。 目的：了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：体外培养脐带间充质干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测脐带间充质干细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、CCK-8观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：转染碱性成纤维细胞生长因子后,转染组与对照组、空载病毒组相比碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。说明,通过重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染能促进体外培养的脐带间充质干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

骨形态发生蛋白2及碱性成纤维生长因子2对大鼠骨髓间充质干细胞膜片增殖和成骨分化的影响

文题释义：细胞膜片技术：是在体外接种培养高密度的细胞,使其相互融合生长至100%而形成的透明致密膜状物。该技术不需要胰酶消化即可收集细胞,因此保留了大量的胞外基质、细胞间连接以及细胞-基质连接等结构。目前细胞膜片技术已成为组织工程领域的研究热点,已被推广应用于牙周膜、角膜、心脏、软骨、食管等多种组织器官修复。成骨细胞：主要由内外骨膜和间充质始祖细胞分化而来,在复杂的骨形成过程中发挥着主要的功能,承担着骨基质的合成、分泌和矿化。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,能定向分化为成骨细胞,其成骨分化过程可受多种因素的影响,如细胞因子的调控、遗传因素和激素水平等。背景：现阶段骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2对骨髓间充质干细胞膜片增殖、成骨分化的影响和作用机制还尚未可知,如何将生长因子与组织工程细胞膜片技术相整合,最终将其用于骨缺损修复具有重要意义。目的：探讨单独及联合应用骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2对骨髓间充质干细胞膜片增殖和成骨分化的影响。方法：体外分离培养鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞并构建细胞膜片,选用不同质量浓度的骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2单独及联合诱导骨髓间充质干细胞膜片,CCK-8法结合碱性磷酸酶活性检测确定2种因子促进膜片增殖和成骨分化的最佳有效质量浓度;然后对骨髓间充质干细胞膜片进行成骨诱导,通过大体及显微镜观察、Vonkossa染色、茜素红染色、RT-PCR检测相关成骨标志物来评估诱导效果。结果与结论：单独应用骨形态发生蛋白2可增强骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性,最佳质量浓度为100 μg/L(P < 0.001),单独应用碱性成纤维生长因子2能加速骨髓间充质干细胞膜片的增殖,最佳质量浓度为20 μg/L(P < 0.001),而联合应用既可以促进膜片增殖又能提高其碱性磷酸酶活性(P < 0.001);经成骨诱导后,4组膜片在形态学上无明显差异,均能诱导骨髓间充质干细胞膜片的成骨分化,其中联合组钙结节最明显(P < 0.001),可显著促进膜片晚期成骨分化并抑制其早期成骨分化,具有明显的协同促进作用(P < 0.001)。结果表明,骨形态发生蛋白2和碱性成纤维生长因子2联合应用时具有协同作用,既可以促进骨髓间充质干细胞膜片增殖,又能显著增强其成骨诱导能力。ORCID: 0000-0003-1918-579X(何惠宇)中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Current concepts on the molecular pathology of non-small cell lung carcinoma

Recent advances in the understanding of the complex biology of non-small cell lung carcinoma (NSCLC), particularly activation of oncogenes by mutation, translocation and amplification, have provided new treatment targets for this disease, and allowed the identification of subsets of NSCLC tumors, mostly with adenocarcinoma histology, having unique molecular profiles that can predict response to targeted therapy. The identification of specific genetic and molecular targetable abnormalities using tumor tissue and cytology specimens followed by the administration of a specific inhibitor to the target, are the basis of personalized lung cancer treatment. In this new paradigm, the role of a precise pathology diagnosis of lung cancer and the proper handling of tissue and cytology samples for molecular testing is becoming increasingly important. These changes have posed multiple new challenges for pathologists to adequately integrate routine histopathology analysis and molecular testing into the clinical pathology practice for tumor diagnosis and subsequent selection of the most appropriate therapy.