应用等位基因特异聚核酶链式反应鉴别半夏类药材

 目的建立能区分半夏正、伪品的分子鉴定方法。方法下载GenBank中半夏属、犁头尖属及天南星属相关序列,利用DNAMAN进行比对分析,根据ITS序列中半夏的SNP位点设计引物PtITS178F和PtITS555R,采用等位基因特异PCR进行扩增。结果对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测。引物PtITS178F和PtITS555R只对半夏类药材扩增395 bp片段,虎掌和水半夏均无扩增条带。结论等位基因特异PCR能准确检测半夏的SNP位点,达到准确鉴别半夏正伪品的目的,是一种有前途的中药材分子鉴定方法。     

虎掌南星超快速Real-time VPCR闭管检测方法的建立及应用

目的建立虎掌南星Pinellia pedatisecta特异性DNA的闭管式超快速检测方法,实现对虎掌南星样本的快速鉴别。方法针对虎掌南星特异性的DNA序列设计其特异性的引物和TaqMan探针,通过对扩增体系进行优化,建立虎掌南星的超快速实时荧光VPCR扩增体系,实现对虎掌南星特异性DNA的快速扩增和闭管式实时检测。同时对该方法的特异性、灵敏度和实用性进行考察。结果可以在24 min内完成对虎掌南星特异性DNA的闭管快速扩增检测;检测限低至pg级DNA;在同科属常见近缘品种中无交叉反应;对采集的7批56个"半夏"样本进行分析,检测出2个批次共16个样本为虎掌南星,且该结果与测序结果 100%符合。结论所建方法可以作为虎掌南星的特异性检测方法,具有灵敏、快速和不易污染等优点,可以为虎掌南星和半夏药材的质量控制提供参考。     

半夏的本草考证

通过考证认为:20世纪以前中药半夏的原植物是天南星科植物半夏Pinellia ternata;而前人曾将道地药材“齐州半夏”(产于山东省历城县)误考为只分布于日本的三裂叶半夏P. tripartita。同时证明古代本草中常混为半夏的“由跋”是同属植物虎掌P. pedatisecta的幼小块茎,而不是天南星属植物Arisaema ringens。     

半夏与近缘品虎掌南星薄层色谱鉴别

目的:建立半夏与虎掌南星的薄层色谱鉴别方法,解决目前市场上存在的部分掺伪现象。方法:以乙醇为提取溶剂,三氯甲烷-甲醇-水(6∶4∶0.5)为展开剂,10%硫酸乙醇溶液为显色剂,对半夏与虎掌南星进行薄层色谱鉴别。结果:在365nm紫外灯下,半夏与虎掌南星的薄层色谱图存在明显差异,半夏薄层色谱图中有两个黄绿色斑点,而虎掌南星只有一个黄绿色斑点。结论:该方法可以快速有效鉴别半夏和虎掌南星,且重复性好,专属性强,可解决市场上半夏伪品问题,提高临床用药的安全性和可靠性。     

基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅰ)——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的 :分析半夏Pinelliaternata(Thunb .)Breit.及其伪品虎掌南星PinelliapedatisectaSchott的核基因组序列 ,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法 :采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18SrRNA基因核苷酸离列并作序列变异和选择性内切酶谱 (PCR SR )分析。结果 :半夏和伪品的 18SrRNA序列长度均为 180 5bp ,根据排序比较 ,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同 ,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异 (有 4个变异位点 )。在半夏 18SrRNA序列中有一个限制性内切酶AseⅠ识别位点 ,通过PCR SR图谱显示 80 0bp和 90 0bp2个酶切片断 ,而虎掌南星则无此位点 ,PCR SR图谱显示 1个未消化的 180 0bp片断。 结论 :通过核基因组序列和PCR SR图谱差异 ,DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法     

获取人参、西洋参特定序列位点(STS)标记的新方法

目的：寻找人参、西洋参的分子鉴定新方法。方法：在人参、西洋参已知rDNA序列上设计单引物进行PCR扩增,对多态性条带克隆测序,根据序列比对情况设计人参、西洋参特异引物,通过对PCR条件的优化得到人参、西洋参的STS 标记。结果：引物Pg-q36F能得到人参、西洋参的多态性条带,特异引物Pg-6F,Pg-479R仅对人参扩增474 bp条带,特异引物Pq-442F,Pq-658R仅对西洋参扩增217 bp条带,能成功鉴定人参和西洋参。结论：建立了一种获取人参、西洋参STS标记的新方法。本方法大大加快STS标记的建立过程,可为其他中药材分子标记的获得提供指导。     

虎掌南星及其混淆品的鉴别研究

目的:建立鉴别虎掌南星及其5种混淆品的方法。方法:采用性状鉴别方法,通过形状、大小、表面、颜色、断面、气味对虎掌南星及其混淆品天南星、半夏、朝鲜南星、螃蟹七、白附子进行鉴别;采用薄层色谱法对虎掌南星及其5种混淆品的甲醇提取溶液进行鉴别。结果:虎掌南星"形如虎掌、色白粉性"的性状特征可以区分正品和5种混淆品;薄层色谱中,虎掌南星甲醇提取液在紫外灯(365nm)和日光灯下,在Rf=0.48位置处分别有一蓝色荧光斑点和一紫红色斑点,而其他5种混淆品均无此斑点,可以区分正品与混淆品。结论:建立的性状和薄层色谱方法专属性强,可用于虎掌南星及其混淆品的鉴别。     

天南星和半夏的显微及理化鉴别

中药天南星的植物来源甚多 ,市售商品复杂 ,均为天南星科天南星属植物的块茎。历来认为“虎掌”是天南星中的佳品 ,但近年来经过本草考证和实际调查研究认为“虎掌”是半夏属植物掌叶半夏的块茎。为防止使用混乱 ,现对《中国药典》2 0 0 0年版一部收载的三种天南星及半夏[1] 和《江苏省中药材标准》1 989年版收载的掌叶半夏[2 ] 计五种植物的块茎进行了显微、理化方面的实验鉴别。简述如下。1　天南星1 .1　来源　为天南星科植物天南星 Arisaema con-sanguineum Schatt.,东北天南星 A.amurense Max-im.或异叶天南星 A.heterophyllum Bl.…     

天南星、半夏的PCR-RFLP鉴别

目的：近年来,随着半夏和天南星的野生资源急剧下降、药材栽培技术不成熟等问题出现,市场的混伪品频繁出现,而其主要鉴别特征在药材流通中大多消失。因此,迫切需要建立一种可以快速、有效鉴别天南星和半夏特异性的分子鉴定方法。方法：通过比对天南星、半夏及其混伪品的rbc L序列,分别选择了天南星和半夏的特异性酶切位点HaeⅢ和DraⅠ,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）进行鉴定,建立并优化了PCR-RFLP反应主要体系条件,并对其耐用性和正品、掺杂品及混伪品的检出能力进行了考察。结果：建立了天南星和半夏药材的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度为54℃、循环次数为35个,DNA模板量为3～30 ng时,天南星和半夏经过特异性引物扩增后,分别能被HaeⅢ和DraⅠ限制性内切酶酶切,产生两片段或切开的小片段,并在100～250 bp出现单一条带,而混伪品无法酶切,且均在250 bp出现条带,该方法对天南星或半夏的掺杂品和混伪品具有高度准确的鉴别能力。结论：该研究建立的PCR-RFLP方法可以快速鉴别天南星、半夏。     

一测多评法定量分析半夏及其混伪品中的4种核苷类成分

目的 建立一测多评法测定半夏Pinellia ternate及其混伪品天南星Arisaema erubescens、水半夏Typhonium flagelliforme和虎掌南星Pinellia pedatisecta中尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷的含量方法。方法 利用高效液相色谱法,采用Shim-pack Scepter C₁₈-120色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相10%乙腈-水,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;检测波长260 nm;柱温20℃。以腺苷为内标,建立尿苷、腺嘌呤和鸟苷的相对校正因子,同时采用外标法和一测多评法测定多批次药材中4种成分的含量,验证一测多评法的准确性和可行性。结果 尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷在各自线性范围内线性关系良好(r>0.999 9),平均加样回收率95.40%~104.02%,一测多评法和外标法测得的含量无显著差异(RSD<3%),不同产地的半夏中4种核苷含量显示有明显差异。除天南星外,基于核苷的含量测定结果结合化学计量分析可以很好地区分半夏、水半夏和虎掌南星。结论 该方法简便准确度高,可为半夏的质量控制和评价提供参考。     

蛤蚧及其伪品微型DNA条形码的引物筛选

文章旨在筛选出适合于扩增蛤蚧及伪品微型DNA条形码引物。通过引物设计软件,经过多序列比对,设计了两对引物mini-barcode F2,mini-barcode R2;mini-barcode F3,mini-barcode R3,并用这两对引物和目前已报道的微型条形码引物PCR扩增蛤蚧及伪品61个样本,结果表明mini-barcode F2,mini-barcode R2和mini-barcode F3,mini-barcode R3这两对引物的PCR扩增成功率分别为100%和90%,而目前已报道的微型条形码引物PCR扩增蛤蚧及其伪品得到了长度约500 bp非微型条形码序列片段。因此目前已报道的微型条形码引物不适用于扩增蛤蚧及伪品,该研究筛选出了适合于蛤蚧及伪品的微型条形码引物。     

基于ITS2序列SNP位点鉴定白及药材及其混伪品

为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增rDNA ITS2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点。结果显示,ITS2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点。针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412R,HHBJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生。该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法。     

半夏种质资源遗传多样性的SRAP分析

目的:利用SRAP标记技术对全国不同产地和表型的半夏居群进行了遗传多样性分析.方法:从80对引物中筛选出14对合适的引物进行半夏不同居群的SRAP分析,用SPSS 16.0软件分析,建立Jaccard相关系数矩阵,构建遗传树系图.结果:14对SRAP引物共扩增出171条带,多态位点百分率为15.8%,35个半夏居群中表型先于产地聚类在一起.结论:SRAP标记适合于半夏的DNA遗传多样性分析;在半夏种质资源划分上产地较表型更为重要.     

蝙蝠蛾拟青霉及金水宝胶囊的DNA条形码鉴定

目的:由于传统方法对发酵菌丝体鉴定困难,采用DNA条形码技术对金水宝胶囊原料菌种蝙蝠蛾拟青霉及相关产品进行快速鉴定。方法:采用内转录间隔区(ITS)序列对收集的蝙蝠蛾拟青霉及其易混淆物种共8种168份样品进行条形码鉴定,并基于ITS序列设计蝙蝠蛾拟青霉特异引物对相关产品进行快速鉴定。结果:44份不同来源蝙蝠蛾拟青霉的ITS序列长度均为499 bp,无变异位点。基于ITS序列可对蝙蝠蛾拟青霉及其7种易混伪品进行区别;通过ITS序列设计的蝙蝠蛾拟青霉特异性引物(ITS-BF/ITS-BR)可特异扩增得到长度102 bp的短片段,采用该片段可快速鉴别蝙蝠蛾拟青霉与其他虫草菌,并可区分市场上相关产品。结论:通过ITS序列及特异性引物可以实现蝙蝠蛾拟青霉及其相关产品的快速鉴定,为金水宝胶囊的生产及质量控制提供参考。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

基于特异性PCR的梅花鹿茸和马鹿茸区分

目的:开发及验证梅花鹿和马鹿茸的特异性聚合酶链式反应(PCR)筛选方法。方法:采集梅花鹿茸、马鹿茸、鹿茸混淆品、香港市场流通的鹿类产品、非鹿科动物、植物和真菌类样品。对鹿类线粒体基因组进行排序,设计及筛选特异性引物,采用特异性PCR对样品进行区分,并进行条件优化和方法学验证。结果:共收集77份样品,对87份线粒体基因组DNA排序并设计9个特异性引物组合。经验证后,CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r分别选作梅花鹿和马鹿的特异性引物组合,通过PCR可获得223 bp的梅花鹿和248 bp的马鹿特异性条带,作为区分梅花鹿茸和马鹿茸的依据。结论:该方法能作为中药鉴别的补充方案,用于质量控制中涉及动物制品的种属,进一步完善鹿茸饮片鉴别体系。