一种简便的大鼠肝脏星状细胞分离培养方法及鉴定

目的 探索简单经济的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)分离培养方法,提高实验效率.方法 取SD大鼠,行肝脏门静脉插管,用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶灌注,消化.细胞悬液经Percoll密度梯度离心液分离,台盼蓝染色鉴定细胞活性,Desmin抗体免疫组化鉴定纯度.结果 HSCs得率为(2.35...     

钒对睾丸支持细胞／生精细胞的体外毒性研究

钒对睾丸支持细胞／生精细胞的体外毒性研究李宏霞，杨在昌，张天宝，曾祥贵（成都华西医科大学环境卫生学教研室６１００４１）已有研究表明，Ｖ２Ｏ５对雄性大鼠有明确的生殖毒性，但对其毒作用机制尚缺乏深入的研究。本实验在建立大鼠支持细胞／生精细胞（Ｓｅｒｔｏｌ...     

PCB153对原代培养大鼠睾丸支持细胞SOD活性、DNA损伤及凋亡的影响

目的：探讨2,2′,4,4′,5-五氯联苯（2,2′,4,4′,5-hexachlorobiphenyl,PCB153）暴露对原代培养大鼠睾丸支持细胞（Sertoli cells,SC）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、DNA损伤、细胞凋亡的影响以及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）的干预作用。方法：原代培养出生18～20d雄性SD大鼠的睾丸支持细胞,设PCB153不同浓度的染毒组（加入10、20、30μmol/L PCB153）,NAC组（以300μmol/L NAC预处理1h后加入30μmol/L PCB153）,和对照组（加入与PCB153最大染毒量等体积的DMSO）,各组细胞经上述处理后继续培养24h,用SOD试剂盒测定各组细胞SOD活性,彗星实验测定DNA损伤程度,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞荧光标记观察凋亡形态。结果：染毒24h后,大鼠睾丸支持细胞SOD活性随着PCB153染毒剂量的升高而降低,20、30μmol/L染毒组显著低于对照组（P〈0.05）,NAC预处理可提升SOD活性（P〈0.05）。各PCB153处理组及NAC预处理组与对照组相比,DNA损伤间的差异均无统计学意义（P〉0.05）,细胞凋亡率则均显著增加（P〈0.05）,NAC预处理可降低PCB153所致的凋亡率（P〈0.05）。结论：10～30μmol/L PCB153染毒24h可诱导的原代培养大鼠SCSOD活性降低,细胞凋亡增加,但并未引起DNA损伤,NAC预处理具有保护作用。     

应用长春新碱分离与鉴定U87细胞系中的胶质瘤干细胞

背景与目的:研究表明,肿瘤干细胞具有化疗抵抗性.本研究拟利用肿瘤干细胞对化疗药物耐受的特性,在培养基中添加长春新碱的方法从人胶质瘤细胞系U87中分离鉴定肿瘤干细胞.方法:U87细胞于含血清培养基中贴壁后,换用含有5 ng/ml长春新碱的神经干细胞培养基培养,获得第一代肿瘤细胞球后,将单细胞接种于神经干细胞培养基中,获得第二代肿瘤细胞球.免疫荧光检测巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)在第二代肿瘤细胞球及其分化细胞中的表达.结果:成功地获得了第一代肿瘤细胞球以及来源于单细胞的第二代肿瘤细胞球;细胞间紧密相贴,表面较光滑;神经干细胞标志物nestin在第二代肿瘤细胞球中呈阳性表达;第二代肿瘤细胞球分化细胞中可检测到nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、MBP的表达.结论:U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞,采用神经干细胞培养基中添加长春新碱的方法能简单有效地从胶质瘤细胞系中分离培养出胶质瘤干细胞.     

大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定

背景与目的： 探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法,建立一种简便、稳定的细胞模型。 材料与方法： 选用SD雌性大鼠(21～25 d),皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后用颈椎脱臼法处死,剖取双侧卵巢,采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞,0.25％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞,用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于37 ℃,5％ CO2培养箱培养。以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定,用MTT法绘制细胞生长曲线,并检测细胞培养液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 结果： 分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90％,细胞纯度达到95％以上;体外培养的颗粒细胞对数生长期为48～96 h;颗粒细胞具有正常的分泌雌激素功能,在培养24 h细胞培养液中E2和P的分泌量分别为(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 结论： 采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好,用FSHR表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。     

鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群的分离及初步鉴定

  目的   分离和鉴定具有肿瘤干细胞特性的鼻咽癌球形成细胞亚群。   方法   利用无血清干细胞球悬浮培养技术从不同分化程度鼻咽癌细胞株中分离成球细胞,然后利用MTT法,软琼脂克隆形成实验,分别评价成球细胞的耐药性、克隆形成能力,最后利用RT-PCR和免疫荧光细胞技术分析干性基因及Wnt信号通路关键转录因子β-catenin在成球及未成球细胞中的表达情况。   结果   低分化鼻咽癌细胞含有较高成球细胞,而高分化细胞株CNE-1中未见成球细胞。与CNE-2相比较,CNE-2S（来源于CNE-2的成球细胞）具有较强的抗肿瘤药物耐药性、克隆形成能力、高表达干性基因,且β-catenin在胞浆和核内都呈高表达。   结论   本研究分离到干细胞样鼻咽癌成球细胞亚群,为最终靶向杀灭鼻咽癌肿瘤干细胞提供了可能。      

纳米镍对大鼠睾丸生精-支持共培养细胞的凋亡作用及机制研究

目的：研究纳米镍对大鼠睾丸生精-支持共培养细胞的作用及其相关机制。方法：以体外共培养的大鼠睾丸生精-支持共培养细胞为实验对象,分别加入不同浓度的纳米镍（0、25、50、100、200、400和800 μg/mL）染毒24 h后,采用MTT法检测细胞存活率,Hoechst33258染色法检测细胞凋亡形态及Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;lncRNA基因芯片检测细胞凋亡相关lncRNA的差异表达。结果：与对照组相比,不同浓度纳米镍染毒后,细胞存活率均降低（P < 0.01）,并呈剂量效应关系（P < 0.01）。Hoechst33258染色结果显示,与对照组比较,纳米镍染毒组细胞核或细胞质内显示出浓染致密的颗粒块状荧光及明显核形态变化。Annexin V/PI双染法流式检测结果显示,染毒浓度为25、50、100、200、400 μg/mL时,细胞凋亡率分别为8.80%±0.50%、11.00%±0.70%、12.53%±0.71%、15.95%±0.54%和17.80%±0.76%,各浓度组细胞凋亡率与对照组比较均明显增加（P < 0.01）,且呈浓度效应关系（P < 0.01）。LncRNA基因芯片检测结果显示,与凋亡相关的lncRNA共169个,其中,100 μg/mL纳米镍染毒组与对照组比较,上调的有117个,下调的有52个。结论：纳米镍能引起大鼠睾丸生精-支持共培养细胞凋亡,lncRNA可能在其中起重要作用。     

不同转移潜能癌细胞亚系分离鉴定和细胞克隆模型建立及在转移机理研究中应用

我们以三个转移性癌细胞系为基础从每个转移性癌细胞系中分离出不同转移的克隆细胞株，并进行了鉴定，建立I较稳定的不同转移潜能癌细胞亚系和细胞克隆模型。利用这些克隆细胞株进行了各自与转移性相关因素的研究；转移性癌细胞的丝状伪足内内质网结构、细胞内骨架系统及缝隙连     

视网膜Müller细胞体外培养、纯化与鉴定方法的研究进展

视网膜Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞,其贯穿着整个视网膜,为神经元细胞提供营养、促进视网膜祖细胞向神经元分化[1]及保护光感受器细胞等[2]功能;同时也通过多种途径参与视网膜的病理生理过程[3]。因此,建立Müller细胞有效的体外培养体系,有利于进一步研究其在视网膜的生理活动及病理过程中所起的作用。目前国内外学者都在努力探寻体外稳定地培养大量单一Müller细胞的有效方法。现就Müller细胞的培养、分离、纯化、鉴定等方法的研究进展作一综述。     

肺癌干细胞培养、鉴定及其应用的研究进展

肺癌的发病率呈逐年上升趋势,由于缺乏有效的早期诊断方法以及治疗手段,其5年生存率较低,是威胁人类健康的一大难题。目前治疗方法主要以手术和放化疗为主。“肿瘤干细胞学说”的提出为肺癌的研究开辟了一条新的途径,它被认为是肿瘤复发的根源,那么其分离和鉴定就显得尤为重要。其中肺癌干细胞的主要分离方法有SP细胞分选法、利用干细胞表面标志分选法、利用免疫磁珠分选法联合无血清悬浮培养法、放化疗诱导筛选法等;肺癌干细胞初步鉴定的主要方法有增殖能力、分化能力、耐放化疗性、侵袭能力、致瘤性鉴定等。肺癌干细胞的分离将为实现早期诊断、靶向治疗、基因疗法及药物干预等打下基础,为治疗肺癌,甚至彻底根除肺癌带来了新的希望。本文主要就肺癌干细胞的分离培养、鉴定及其在肺癌治疗方面的应用等的研究进展作一综述。     

Coexpression of Multiple Sertoli Cell and Leydig Cell Marker Genes in the Spontaneous Testicular Tumor of F344 Rat: Evidence for Phenotypical Bifurcation of the Interstitial Cell Tumor

The development of testicular tumor has been frequently observed in some laboratory rat strains. In the present study, we have further characterized the testicular tumor that spontaneously develops in the F344 rat (F344/Jcl). Tumor cells first appeared in the interstitium and developed into multifocal nodular lesions. In the later stage, the whole testes were occupied by tumor cells that consisted of three different types of cells in morphological appearance: large clear type, small eosinophilic type and intermediate type. To determine the character of these cells, we examined the expression of marker genes for Sertoli cells (e.g., transferrin) and Leydig cells (e.g., 3β–hydroxysteroid dehydrogenase 1 (3β–HSD 1)). Transferrin and 3β–HSD 1 mRNAs were found in all 8 tumor samples analyzed hy northern blotting. By in situ hybridization, we observed a substantial amount of 3β–HSD 1 mRNA and little or no transferrin mRNA in the large clear cells. In contrast, the small eosinophilic cells showed little or no 3β–HSD 1 mRNA and a large amount of transferrin mRNA, suggesting that the tumor was a mixture of at least two types of cells. Other Sertoli cell marker genes, such as cyclic protein 2 and sulfated glycoprotein 2, were expressed in all 8 tumors analyzed, and testin and steel factor (SLF), the c–kit receptor ligand, were also expressed in some of the tumors (testin, 75%; SLF, 25%), while other Leydig cell markers, LH receptor and c– kit , were expressed in 87% and 80% of the tumors, respectively. These results indicate that the spontaneous testicular tumor of F344 rat is of interstitium origin, showing phenotypical bifurcation possibly via transdifferentiation.     

无血清培养法分离并鉴定胰腺癌细胞系BxPC-3中肿瘤干细胞

[目的]从人胰腺癌细胞系BxPC-3中分离并鉴定胰腺癌干细胞。[方法]用无血清培养基培养人胰腺癌BxPC-3得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,观察各传代后细胞成球能力;并用含血清培养基诱导促使其分化;蛋白印迹法测定肿瘤干细胞特异性转录因子OCT-4蛋白表达情况,并将肿瘤细胞球细胞植入NOD/SCID小鼠皮下,观察移植瘤的形成。[结果]在无血清培养基中,BxPC-3细胞能形成少量肿瘤细胞球,具有很强的自我更新能力,成球能力随着球体细胞传代次数的增加而增加。在含血清环境中,球体细胞逐渐分化而呈贴壁生长。肿瘤细胞球OCT-4蛋白表达明显高于BxPC-3贴壁细胞。1×104个球体细胞即能在NOD/SCID小鼠皮下成瘤。[结论]无血清培养能够有效的分离和扩增人胰腺癌细胞系BxPC-3的肿瘤干细胞。     

Isolation and Properties of Tumor-derived Endothelial Cells from Rat KMT-17 Fibrosarcoma

Rat KMT-17 fibrosarcoma-derived endothelial cells were isolated by Percoll gradient centrifugation with an attaching-speed separation technique, and their properties in culture were examined. The primary cultured tumor-derived endothelial cells (TEC) showed angiotensin-converting enzyme activity, positivity for Factor VIII-related antigen staining, and typical capillary-like formation on Matrigel. The primary cultured TEC monolayer showed greater permeability than normal tissuederived endothelial cell (aorta, vena cava and epididymal fat capillary) monolayers on FITC-dextran diffusion (molecular weight 70,000). Leukocyte adhesion to TEC was reduced compared to that to fat-derived capillary endothelial cells. These characteristics resembled those of tumor vascular endothelium, and were observed both in the primary and first-passage cell cultures, but not in the fourth-passage cell cultures. Our findings indicate that primary or subcultured TEC are applicable for studies of the physiological characteristics of tumor endothelial cells.     

Large-cell calcifying Sertoli cell tumour of the testis: Associated organ anomalies

A case is reported of unilateral, focal large-cell calcifying Sertoli cell tumour (LCCSCT) of the testis associated with complex endocrine disorders and cardiac myxomas. It is believed that there are two distinct groups of patients with this tumour: those who have complex dysplastic syndromes and bilateral and multifocal tumours; and those without any syndromes but who have unilateral and focal tumours. The presented case differs in that, although the patient has a unilateral focal tumour, unique organ anomalies, such as renal agenesis and inferior vena cava duplication, are also present. These anomalies with LCCSCT have not been reported before.     

人肺腺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离培养及鉴定*

目的：从人肺腺癌细胞系A 549 及H 1299中分离富集含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性。方法：用无血清悬浮培养的方法从人肺腺癌A 549 及H 1299细胞株中富集得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,体外利用CCK-8 法、平皿克隆以及Transwell 小室实验,研究细胞球的增殖情况、自我更新和侵袭转移能力;通过RT-PCR 检测干细胞特异性转录因子Oct4、Nanog基因表达情况;体内利用裸鼠移植瘤形成实验研究肺癌细胞球的成瘤能力。鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果：在无血清悬浮培养下,A 549 及H 1299细胞株3~ 6 天后能形成稳定传代的肿瘤悬浮球,悬浮球的体外自我更新、克隆形成和侵袭转移等能力均高于其亲本细胞（P < 0.05）;干细胞核心基因Oct4 和Nanog的mRNA 表达水平明显升高（P < 0.05）;A 549 悬浮球可以明显提高裸鼠体内成瘤能力。结论：通过无血清悬浮培养法可有效富集A 549 及H 1299细胞系中的干细胞成分,该法可成为快速易行构建肺腺癌干细胞模型的方法。     

不同来源骨髓间质干细胞分离培养及成骨分化比较

目的 间质干细胞(MSCs)是多能成体干细胞,近年关于其在肿瘤相关领域的研究得到了国内外广泛关注.我们分离、鉴定并纯化不同来源的骨髓间质干细胞,比较其在成骨分化的差异,为下一步试验选择良好的细胞来源.方法 采用差速贴壁法分离SD大鼠及Balb/c小鼠骨髓间质干细胞,通过传代纯化,并观察MSCs在此过程中的纯化程度及增殖状况.流式细胞术鉴别两种MDSCs细胞表面抗原的表达.比较不同来源间质干细胞在成骨分化的差异.结果 在SD大鼠MDSCs分离和培养过程中,其增殖能力显著强于Balb/c小鼠MDSCs,在第三代时即可见典型的漩涡状贴壁生长特性.经流式细胞术检测两种来源的细胞均表达间质干细胞表面抗原.在成骨方面SD大鼠MDSCs表现出了较强的多能特性,且SD大鼠出现程度大于Balb/c小鼠.结论 SD大鼠来源MDSCs较易获得纯度较高且增殖旺盛的细胞源,在成骨方面的能力强于Balb/c小鼠,在一定程度上其可成为良好的细胞来源.     

人结直肠肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性

目的 从人结直肠肿瘤细胞中分离培养结直肠肿瘤干细胞(Colon cancer stem cells)并研究其生物学特性。方法 采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞,通过MTT比色法对其体外增殖能力进行鉴定,流式细胞仪分析细胞表面标记CD133、CD166、CD24、CD47、CD200、CD90、CD44、EPCAM的表达情况;PCR检测Oct4、Sox2、Nanog、C-myc等相关基因的表达,实时荧光定量PCR检测其表达量。结果 三例能够形成肿瘤球的原代培养细胞CD166阳性细胞所占比例分别为61.9%、52.4%、47.8%,CD47阳性细胞所占比例分别为99.8%、97.2%、99.9%;不能形成肿瘤球的原代培养细胞中CD166阳性细胞为10.8%,CD47阳性细胞为0.1%;CD133、EPCAM、CD24、CD200四个表面标记在两种细胞中的表达均低于0.5%,CD44、CD90在两种细胞中的表达均高于95%;与原代细胞相比,克隆细胞具有较强的体外增殖能力并且高表达Oct4(P<0.05)、C-myc (P<0.01)及Sox2基因,不表达Nanog基因。结论 人结直肠肿瘤中存在具有自我更新和增殖潜能的结直肠肿瘤干细胞,在体外可将其分离、培养和纯化。     

不同来源骨髓间质干细胞分离培养及成骨分化比较

目的：间质干细胞（MSCs）是多能成体干细胞,近年关于其在肿瘤相关领域的研究得到了国内外广泛关注。我们分离、鉴定并纯化不同来源的骨髓间质干细胞,比较其在成骨分化的差异,为下一步试验选择良好的细胞来源。方法：采用差速贴壁法分离SD大鼠及Balb/c小鼠骨髓间质干细胞,通过传代纯化,并观察MSCs在此过程中的纯化程度及增殖状况。流式细胞术鉴别两种MDSCs细胞表面抗原的表达。比较不同来源间质干细胞在成骨分化的差异。结果：在SD大鼠MDSCs分离和培养过程中,其增殖能力显著强于Balb/c小鼠MDSCs,在第三代时即可见典型的漩涡状贴壁生长特性。经流式细胞术检测两种来源的细胞均表达间质干细胞表面抗原。在成骨方面SD大鼠MDSCs表现出了较强的多能特性,且SD大鼠出现程度大于Balb/c小鼠。结论：SD大鼠来源MDSCs较易获得纯度较高且增殖旺盛的细胞源,在成骨方面的能力强于Balb/c小鼠,在一定程度上其可成为良好的细胞来源。