次级淋巴组织趋化因子基因转染对小鼠黑色素瘤细胞生物学特性的影响

目的研究次级淋巴组织趋化因子（SLC）基因转染对小鼠恶性黑色素瘤细胞生物学特性的影响。方法采用脂质体法将小鼠SLC基因转染至小鼠恶性黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选出转基因细胞克隆。体外检测SLC基因转染恶性黑色素瘤细胞的增殖,并通过趋化小室法检测细胞培养基上清液中SLC的趋化活性。检测野生型和基因转染的恶性黑色素瘤细胞在体内的致瘤性,并病理检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润。结果SLC基因转染的恶性黑色素瘤细胞和野生型恶性黑色素瘤细胞在体外的增殖没有明显差别。分泌于细胞培养基上清液中的SLC表现出了趋化活性。SLC基因转染并没有降低细胞的致瘤性,但是移植瘤的生长明显慢于野生型恶性黑色素瘤细胞移植瘤的生长,并且病理证实SLC基因转染的肿瘤细胞移植瘤内呈现明显的淋巴细胞浸润。结论SLC基因转染在小鼠黑色素瘤能诱导抗肿瘤免疫,有可能被应用于恶性肿瘤的免疫治疗。     

小鼠趋化因子COL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列，经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3．1-CCL19Ig，酶切和测序鉴定插入序列；将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达，通过RT—PCR、Western blot鉴定目的基因的表达，利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgGI Fc段序列，其序列分别与GenBank中公布序列比对一致，IgG1-Fc段读码框未发生改变；Western blot结果证实转染了pcDNA3．1-mCEL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38000的融合蛋白mCCL19Ig表达；体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性，且呈剂量依耐关系。     

SLC基因修饰树突状细胞及不同免疫方式抗肿瘤作用探讨

目的：应用次级淋巴组织趋化因子（SLC）成熟肽基因／重组腺相关病毒（rAAV—SLC）转染树突状细胞（DC），探讨一种基因修饰DC的新方法及其抗肿瘤的生物学活性。方法：体外构建rAAV-SLC，按MOI为10、50、100与腺病毒（Ad2）协同转染小鼠骨髓来源成熟和未成熟DC，GFP作为成功转染的示踪蛋白。RT—PCR在mRNA水平、ELISA在蛋白水平检测SLC表达，Transwell检测转染DC的培养上清对T细胞的趋化作用。瘤苗的在体效应通过C57BL／6J小鼠肿瘤模型验证。皮下接种Hepal-6肿瘤细胞后成瘤小鼠分成3组：①生理盐水对照组，瘤内或足垫注射NS；②单纯DC对照组，瘤内或足垫注射未修饰DC；③SLC基因修饰DC组，瘤内或足垫注射SLC基因修饰的DC。每隔7天注射1次，观察各组小鼠肿瘤的生长情况。4周后分离瘤体，用荧光免疫组化检测瘤体内CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞浸润情况。结果：rAAV—SLC在MOI为100时能成功转染DC，未成熟DC的转染效率显著高于成熟DC，并产生对T细胞有明显趋化生物学活性的SLC。动物实验表明，瘤内注射SLC修饰后DC，肿瘤大小与对照组有明显差异，免疫组化显示瘤体内有较多的CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞浸润。足垫注射SLC修饰的DC与对照组相比，抗肿瘤作用无显著差异。结论：rAAV—SLC在Ad2的辅助下能有效转染未成熟DC并能表达具有趋化生物学活性的SLC。SLC基因修饰的树突状细胞瘤内注射以其对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的吸引作用而发挥了明显的抗肿瘤作用，同时也进一步证实用树突状细胞进行肿瘤生物免疫治疗时，不同免疫方式对疗效有明显影响。     

SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究

目的：观察次级淋巴组织趋化因子（SLC）真核表达质粒剂量-趋化效应关系及不同剂量体内应用时对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法：构建了小鼠SLC真核表达质粒（pSLC），体外转染检测pSLC在体外的剂量-趋化效应关系，体内不同剂量的pSLC质粒局部注射检测其表达情况及体内的剂量-趋化效应关系，并观察不同剂量的pSLC对小鼠H22肝癌治疗的剂效关系。结果：当剂量在0．5μg以下时，pSLC在体外转染的趋化效应与转染剂量呈正相关，但在0．75μg时明显下降；pSLC体内局部注射时，在所检测的200μg剂量以内，随注射质粒剂量的增加，其表达的mRNA水平逐渐增加，相应地，对淋巴细胞的趋化作用亦逐渐增强，pSLC对肿瘤的抑制作用亦随其剂量的增加而明显增强（P〈0．001）。结论：体内局部转染表达pSLC，能够有效趋化聚集免疫细胞，对肿瘤产生免疫治疗效应。通过提高转染表达效果，可增加SLC趋化作用，增强肿瘤免疫治疗效应。     

小鼠4-1BBL cDNA的克隆和表达及其抗肝癌的免疫作用

目的 :克隆小鼠 4 1BBL基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在抗肝癌免疫中的作用。方法 :取C5 7BL/6小鼠脾细胞 ,经PHA诱导后 ,以RT PCR克隆 4 1BBLcDNA ,测序 ,构建真核表达质粒 pcDNA3.1( ) m4 1BBL。以重组体转染小鼠肝癌细胞Hepa1 6 ,经G4 18筛选后 ,以RT PCR、间接免疫荧光及流式细胞仪 ,检测m4 1BBL以获得稳定高表达克隆。然后将其制成肿瘤细胞疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养 ,采用MTT比色法测定淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果 :从小鼠脾细胞中克隆到m4 1BBLcDNA ,经测序完全正确。所构建的真核表达质粒pcDNA3.1( ) m4 1BBL ,在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中获得稳定高效表达。与野生型Hepa1 6细胞相比较 ,m4 1BBL基因转染的Hepa1 6细胞疫苗能较有效地诱导淋巴细胞产生针对野生型Hepa1 6细胞的特异性杀伤活性 (P <0 .0 1)。结论 :将m4 1BBL基因导入肝癌细胞中表达 ,能提高其免疫原性 ,诱导有效地抗肝癌免疫应答     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

SmB/B’抗原表位的表达及其免疫原性研究

为了构建SmB/B’抗原表位的真核表达载体 ,通过体内、外进行表达并研究其免疫原性 ,采用异硫氰酸胍一步法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA ,通过RT PCR方法克隆了含编码SmB/B’抗原表位的目的DNA ,构建了其真核表达质粒pcDNA3 fSmB/B’ ,体外转染HeLa细胞检测其表达及与抗体结合活性。体内采用基因免疫的方法对其免疫原性进行研究。结果 :成功构建pcDNA3 fSmB/B’真核表达质粒 ,Westernblot显示其在真核细胞内可有效表达且与抗SmB/B’抗体具有结合活性 ,经基因免疫实验组小鼠皆产生抗SmB/B’抗体。构建的SmB/B’抗原表位真核表达载体可在体内、外有效表达 ,且表达的抗原表位具有免疫原性     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

转染PF4 cDNA的GRC-1细胞培养液对于ECV-304细胞生长及VEGF表达的影响

目的：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，检测稳定转染后的GRC-1细胞的培养上清对于血管内皮细胞ECV304的生长以及转染细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：构建真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并经Bgl Ⅱ／Bam HI双酶切鉴定.通过脂质体介导，以该载体稳定转染GRC-1细胞，转染细胞中VEGF因子的表达情况用免疫组化染色法检测，转染细胞的培养上清对于ECV304细胞生长的影响用MTT法检测。结果：经Bgl Ⅱ／BamH I双酶切证实，hPF4 cD—NA已成功地克隆到真核表达载体pcDNA3-CD34-SS中。RT—PCR法检测证实，hPF4 cDNA已成功地转染GRC-1细胞。免疫组化染色检测显示，转染PF4基因的GRC—1细胞的胞浆及胞膜均有VEGF表达，但较转染前明显减弱。细胞计数及MTT法显示，转染后GRC-1细胞的培养上清对ECV304细胞的生长具有抑制作用，吸光度值(A)明显降低。结论：构建了真核表达载体pcDNA3-PF4-SS，并稳定转染GRC-1细胞。转染细胞的培养上清对ECV304细胞的生长及VEGF的表达，均具有明显的抑制作用，为探讨抗肿瘤生长机制和肿瘤疫苗的研制奠定了一定的基础。     

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.     

小鼠诱导性共刺激分子-Ig在小鼠树突状细胞中的表达及其效应研究

目的 获得mICOS-Ig基因修饰的小鼠DC，分析表达产物mICOS-Ig对T细胞活化的影响。方法 采用电转染方法将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，通过ELISA法检测转染小鼠DC 60和96h以及稳定表达的培养上清；观察mICOS-Ig对同种混合细胞培养反应的影响。结果 ELISA法检测证明将mICOS-Ig表达载体转入小鼠DC，获得瞬时表达及稳定表达，mICOS-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应，抑制率达40％，其效应呈剂量依赖性。结论 获得了稳定表达mICOS-Ig融合蛋白的小鼠DC，mICOS-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用。     

CTLA4-Ig在树突状细胞中的表达及效应研究

目的 获得CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,分析表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法 采用脂质体转染方法将CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,通过ELISA法鉴定转染DC细胞48和72h培养上清液及稳定表达的培养上清液,分离Balb/c小鼠和C57BL/10J小鼠淋巴细胞为反应细胞和刺激细胞,观察CTLA4-Ig对同种细胞混合培养反应的影响。结果 将鼠CTLA4-Ig表达载体转入DC细胞,获得瞬时表达及稳定表达,CTLA4-Ig可抑制单向混合淋巴细胞反应,且效应亦呈剂量依赖性。结论 鼠CTLA4-Ig表达产物对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用,其抑制作用随表达载体转染细胞培养上清液的增加而增强。同时获得了稳定表达CTLA4-Ig融合蛋白的CTLA4-Ig转基因修饰的DC细胞,为以后的工作奠定了基础。     

人CCL21基因真核表达载体的构建及表达

为了构建可在哺乳动物细胞内高效表达人次级淋巴组织趋化性细胞因子(hCCL21)的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,以便用于hCCL21基因治疗研究。以BamHI和XhoI双酶切重组克隆pSK-hCCL21,胶回收约540bp的hCCL21目的基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点,转化后进行菌落PCR分析和BamHI、XhoI双酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,Westernblot法检测转染细胞中hCCL21的瞬时表达,趋化小室法检测表达产物对淋巴细胞的免疫趋化作用。结果显示,菌落PCR和酶切鉴定证实,目的基因hCCL21正确插入到真核表达载体pVAX1中,转染COS-7细胞后,细胞培养上清及裂解产物中可检测到重组蛋白hCCL21的表达,并且表达产物对人外周血单个核细胞有明显的趋化活性。已成功构建了可在哺乳动物细胞内高效表达hCCL21基因的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,为进一步研究hCCL21基因治疗肿瘤奠定了基础。     

小鼠B7-H4慢病毒表达载体的构建及对脾细胞增殖的影响

目的:构建小鼠B7-H4(mB7-H4)慢病毒表达载体并观察B7-H4蛋白对脾细胞增殖的影响。方法:从BALB/c小鼠肺脏中克隆B7-H4基因,构建表达载体mB7-H4-EGFP,酶切后克隆入慢病毒表达载体pCDH1-MCS1-EF1-Puro中,命名为pCDH1-mB7-H4-EGFP;以包含起始密码和多克隆位点的寡核苷酸取代mB7-H4作为对照载体pCDH1-Control-EGFP。分别与包装载体混合物一起经LipofectamineTM2000转染入293T细胞包装成病毒颗粒,感染293T细胞。pCDH1-mB7-H4-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞分别与BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞混合培养,用MTT法检测其对脾细胞增殖的影响,对照为pCDH1-Con-trol-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞进行的相同处理。结果:mB7-H4被成功克隆,测序证实与GenBank的mRNA核酸序列2个核苷酸有差异,但与其编码的氨基酸一致。pCDH1-mB7-H4-EGFP慢病毒表达载体被成功构建。mB7-H4蛋白表达在293T细胞表面,与对照相比,对BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞增殖均具有明显抑制作用。结论:成功构建小鼠B7-H4慢病毒表达载体,感染293T细胞后表达出对脾细胞增殖具有抑制活性的mB7-H4膜表面蛋白。     

小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究

目的:构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用。方法:从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体。以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达。采用3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用。结果:构建了OX40基因的真核表达载体。经PCR、酶切和测序证实,插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40cDNA序列完全一致。用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞。3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用。OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用。结论:成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用。     

钾依赖钠钙交换蛋白－6（SLC24A6）的基因克隆与蛋白表达

目的：克隆和表达钾依赖钠钙交换蛋白-6（ SLC24A6） 基因，为进一步阐明其与胰岛素分泌的关系奠定基础。方法：利用RT-PCR观察SLC24A6基因在胰岛素瘤和正常胰腺组织中的表达，并克隆SLC24A6基因全 长，将SLC24A6基因构建到原核表达载体pET32a，在大肠杆菌ROSSET菌（DE3）中诱导表达纯 化；将SLC24A6基因构建到绿色荧光真核表达载体pEGFP-C3，利用共聚焦显微镜观察SLC24A6 在小鼠胰岛素瘤β-TC3细胞中的定位。结果：SLC24A6基因在胰岛素瘤组 织表达明显高于正常胰腺；成功获得原核表达纯化蛋白，大小约80 kD；重组载体 pEGFP-C3 -SLC24A6转染后，定位于小鼠胰岛素瘤β-TC3细胞膜上。结论：SLC24A6 可能与胰岛素分泌有关，SLC24A6全长原核表达为进一步研究SLC24A6的生物学功能和蛋白质 晶体结构奠定了基础，SLC24A6在胰岛素瘤细胞的定位为进一步阐明其与胰岛素分泌的关系 提供了理论依据。     

PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型的建立及应用

目的通过构建重组的小鼠pcDNA3.1(+)-PD-L1质粒,并在真核细胞中进行高表达,建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖药物筛选模型用于免疫调节药物的筛选。方法以RT-PCR方法扩增得到小鼠的PD-L1全长片段;以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1;脂质体转染到小鼠成纤维细胞(L929),通过G418筛选得到高表达PD-L1的稳定细胞株并经免疫荧光鉴定;用丝裂霉素处理过的PD-L1高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养;成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型之后向其中加入不同种类、不同浓度的天然产物提取物,并设复孔。结果通过Eco RI/Xho I双酶切及测序证实构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-PD-L1正确。RT-PCR和免疫荧光方法鉴定重组质粒在L929细胞中高效表达,应用流式细胞术成功建立PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的模型,并筛选出阻断PD-L1活性的有效药物。结论获得了稳定高表达PD-L1的细胞,并且用于免疫调节的药物筛选,为免疫调节药物的筛选奠定了实验基础。