荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的 建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化，并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用。方法 复制SD大鼠失血性休克模型，分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)。使用荧光探针Fluo-3／AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化；评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响。结果 休克后2h(失代偿期1，血管反应性明显降低，NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱；加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用，改善细动咏对NE的反应性，带来血管反应性部分恢复。在37℃，Flu-o-3／AM、FuraRed浓度为5μmol／L的条件下，肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40min左右即可获得良好的标记效果。结论 优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放，增多细胞外钙内流并提高血管反应性；使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响，可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化。     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca^2 浓度的动力学变化，建立一种定量测量细胞内Ca^2 浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞，用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca^2 浓度的动力学变化；首先在37℃环境下标定Ca^2 探针indo-1的解离常数Kd值，根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca^2 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示．平滑肌细胞[Ca^2 ]i在地塞米松的刺激下显著上升，有时会出现自发钙波的现象，并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca^2 ]i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化，不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用

目的 研究钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用.方法应用激光共聚焦显微镜成像技术和细胞内记录正常和失血性休克2小时后大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞(arterial smooth muscle cell,ASMC)的钙火花和膜电位的变化.结果休克组的钙火花荧光值比正常组的显著增高并且膜电位显著降低.结论失血性休克2小时.钙火花和BKCa活动增强与ASMC细胞膜超极化密切相关.     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca²⁺浓度的动力学变化,建立一种定量测量细胞内Ca²⁺浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞,用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca²⁺浓度的动力学变化;首先在37 ℃环境下标定Ca²⁺ 探针indo-1的解离常数Kd值,根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca²⁺ 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示,平滑肌细胞[Ca²⁺]_i 在地塞米松的刺激下显著上升,有时会出现自发钙波的现象,并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca²⁺]_i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化,不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

三七花总皂苷对人主动脉血管平滑肌细胞增殖及细胞内钙离子浓度的影响

目的:观察三七花总皂苷(PNFS)对血管平滑肌细胞增殖及细胞内钙离子浓度的影响.方法:采用去甲肾上腺素诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖和钙超载模型,应用CCK-8法观察血管平滑肌细胞增殖活力;钙荧光指示剂Fluo-3/AM检测细胞内钙浓度变化.观察不同剂量PNFS对两者的影响.结果:PNFS能够改善去甲肾上腺素诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖,降低细胞内钙离子浓度,并呈一定的量效关系.结论:PNFS对去甲肾上腺素诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖有抑制作用,这一作用可能与降低细胞内钙离子浓度有关.     

精氨酸血管加压素抗失血性休克作用及其与Rho kinase的关系

目的 观察精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP)抗失血性休克作用与Rho kinase的关系.方法 采用大鼠失血性休克模型,整体动物观察AVP对失血性休克大鼠去甲肾上腺素(NE)的升压反应和对肠系膜上动脉收缩反应性的影响,同时观察Rho kinase在其中的作用;离体血管环观察AVP对失血性休克大鼠肠系膜上动脉反应性和钙敏感性的影响,并观察Rho kinase在其中的作用.结果 失血性休克后大鼠对NE的升压反应性和肠系膜动脉对NE的收缩反应性明显降低,AVP0.4 U/kg可明显增加休克大鼠NE升压反应和肠系膜动脉的收缩反应性,Rho kinase特异性抑制剂Y-27632可明显拮抗由AVP引起的休克大鼠血管反应性的增加.在离体血管环研究表明,休克后血管反应性和钙敏感性明显降低,AVP在浓度为5 nmol/L和0.5 nmol/L可明显增加休克后血管反应性和钙敏感性,Y-27632可明显拈抗由AVP引起的血管反应性和钙敏感性的增加.结论 AVP可通过增加休克血管平滑肌细胞的钙敏感性和血管反应性发挥抗休克作用,通过激活Rho kinase发挥其抗休克作用.     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌大电导钙激活钾通道的特性

目的探讨肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的电生理特性及其与张力调节的可能机制。方法木瓜酶、胶原酶两步消化法急性分离大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞,膜片钳的内面向外式记录法记录BKCa。结果(1)在浴槽液和电极液均为高钾的条件下,BKCa通道的单通道电导为(221±6)pS,反转电位为-0.12 mV;(2)BKCa通道的电流幅度无细胞内钙依赖性,而开放概率(NPo)则同时具有电压依赖性和细胞内钙依赖性。在细胞内钙浓度为0.1 μmol/L时, 使NPo增加e倍的电压增加为(13±1)mV, 达到最大开放概率一半的电压(V1/2)为(22±2)mV;(3)在细胞内钙浓度为1 μmol/L时,可记录到通道长时间的关闭和失活现象,这种现象称为钙依赖性失活。结论肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上的BKCa具有大电导、高钾选择性、强电压依赖性和高度的细胞内钙敏感性。BKCa高度的钙敏感性可能与血管平滑肌病理情况下的代偿调节有关。     

钙库操纵的钙内流在转化生长因子-β1促进气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨钙库操纵的钙内流(SOCE)在转化生长因子-β1(TGF-β1)促进气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用.方法:体外培养大鼠ASMCs,以Fluo-3/AM为细胞内钙离子浓度示踪剂,观察ASMCs在TGF-β1作用后,细胞内基础钙离子浓度、钙释放和SOCE的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定TG...     

GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像研究

目的 研究GCaMP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像.方法 用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCaMP基因的C17.2-GCaMP细胞.Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCaMP细胞中神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达情况.将C17.2细胞(Fluo-4 AM染色后)和C17.2-GCaMP细胞置于定制数字荧光显微镜下进行钙离子荧光检测.结果 Real-time PCR检测结果提示C17.2细胞及C17.2-GCaMP细胞中nestin表达差异无统计学意义(P＞0.05).C17.2-GCaMP细胞较Fluo-4 AM染色C17.2细胞钙离子荧光锐波(spike)波形持续时间长且相对荧光强度强(P＜0.05),在Fluo-4 AM染色C17.2细胞中能观察到钙离子荧光慢波(wave)波形,而C17.2-GCaMP wave波形不典型.结论 C17.2-GCaMP细胞在保持神经干细胞干性的同时能够监测细胞内钙离子变化,能够运用于神经干细胞移植治疗视网膜色素变性功能整合的研究.     

氨培养胎鼠神经细胞钙离子浓度变化与凋亡的相关性

目的 观察体外培养神经细胞在氨作用下钙离子浓度变化与凋亡的关系,探讨氨毒性机制.方法 体外培养胎鼠神经细胞7d,实验分组为对照组、低氨组和高氨组;分别作用24 h后,用流式细胞仪测定神经细胞凋亡比率,用Fluo-3/AM荧光探针测定细胞内钙离子浓度.结果 对照组神经细胞有少量凋亡,细胞内钙离子浓度正常,随着NH4CL浓度的提高,细胞内钙离子浓度明显升高,神经细胞凋亡增加.低氨组和对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）,高氨组和低氨组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 氨诱导神经细胞凋亡与细胞内钙离子浓度相关.     

The role of membrane potential and calcium kinetic changes in the pathogenesis of vascular hyporeactivity during severe shock

Objective To determine the role of membrane potential and intracellular calcium kinetic changes in producing vascular hyporeactivity during severe hemorrhagic shock.Methods Rats were subjected to hemorrhagic shock (HS) for 2 hours.The spinotrapezius muscle was prepared for microscopy and the responses of arterioles in the muscle to norepinephrine(NE) were tested.The resting membrane potentials of isolated arterial strips were measured with a microelectrode.Membrane potential and intracellular Ca(2+)(［Ca(2+)］i) changes in isolated arteriolar smooth muscle cells (ASMCs) were determined with fluorescent probes and a confocal microscopy. Results The arteriolar resting membrane potential was decreased from -36.7±6.3 mV in control to -29.2±5.3 mV concurrent with the increase of vasoreactivity to NE at 20 minutes after HS.At 120 minutes post-HS, the resting potential hyperpolarized to -51.9±9.1 mV, and NE stimulated ［Ca(2+)］i increase was reduced to 50% of the control values during the appearance of arteriolar hyporeactivity, i.e.the NE threshold of the arteriolar response increased 15 fold 2 hours after the onset of hemorrhage as compared with normal animals.The state of vasoreactivity was closely related to the resting potential of vascular smooth muscle in hemorrhagic shock, with a correlation coefficient of 0.96.Treatment with glybenclamide, a selective blocker of ATP-sensitive K(+)(K(ATP)) channels, decreased the resting potential, increased NE-stimulated［Ca(2+)］i increase, and partially restored vasoreactivity in severe hemorrhagic shock. Conclusion The results suggested that membrane hyperpolarization and the reduction of NE-stimulated ［Ca(2+)］i increase in smooth muscle cells appeared to contribute to the vascular hyporeactivity in hemorrhagic shock.The mechanism is likely to involve in K(ATP)channels.     

小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ] i)的影响。方法　采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞 ,用钙敏感的荧光指示剂Fluo 3/AM染色 ,以荧光强度 (FI)来代表 [Ca2 + ] i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化。结果　在静息状态下 ,小檗碱 (3～ 1 0 0 μmol/L)对 [Ca2 + ] i 无影响。 3～ 1 0 0 μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响。但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)对caffeine 1 0mmol/L引起的钙动员有明显促进作用 (P <0 .0 1 )。结论　小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道 (VDC)介导的 [Ca2 + ] i 升高无影响 ;但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网 (SR)内钙外流 ,也可能对SR钙摄取 ,钙的跨膜转运及Na+ Ca2 + 交换有抑制作用     

Effect of melatonin on the spatial and temporal changes of ［Ca2+］i in single living cells of cortical neurons by laser scanning confocal microscopy

Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ (ＭＴ ,Ｎ ａｃｅｔｙｌ 5 ｍｅｔｈｏｘｙｌｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ)ｉｓａｈｏｒｍｏｎｅｓｅｃｒｅｔｅｄｍａｉｎｌｙｂｙｔｈｅｐｉｎｅａｌｇｌａｎｄ ＳｏｍｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＴｃｏｕｌｄｐｒｏｌｏｎｇｌｉｆｅ ,ｐｏｓｔｐｏｎｅａｇｉｎｇ ,ａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆａｇｅ ｒｅｌａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ 1　ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｒｅｅＣａ2 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (…     

LTD4诱导大鼠气道平滑肌细胞收缩的机制

目的探讨LTD4对气道平滑肌细胞（ASMC）收缩的机制。方法 以Fluo-3/AM作为细胞内游离Ca2+示踪剂,通过激光共聚焦显微镜观察LTD4对原代大鼠ASMC细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）及细胞收缩的影响;观察胞外Ca2+、G蛋白。蛋白激酶C（PKC）、丝裂素活化蛋白（MAPK）在LTD4生理效应中的作用。结果　LTD4刺激后,[Ca2+]i上升前有一个潜伏期,随后缓慢增加。随着LTD4浓度上升,潜伏期逐渐缩短（P<0.05）。在无钙溶液中,LTDA诱导的[Ca2+]i上升明显抑制（P<0.01）。随LTD4浓度上升,ASMC收缩程度也有增强趋势（P>0.05）。LTD4诱导的[Ca2+]i上升与细胞收缩程度显著相关（P<0.01）。PTX对LTD4诱导ASMC[Ca2+]i上升和收缩均有明显抑制作用。Staurosporine对[Ca2+]i上升无明显影响,但对收缩有明显抑制作用。PD098059对[Ca2+]i上升元明显影响,对收缩有部分抑制。结论 在大鼠ASMC中,LTD4诱导[Ca2+]i缓慢上升,并有潜伏期。[Ca2+]i在LTD4诱导ASMC收缩中起关键作用。G蛋白、PKC、MAPK在LTD4生理效应中起重要作用。     

氧化低密度脂蛋白,低氧和5—HT对血管平滑肌细胞5—HT2A受？…

为探讨粥样硬化病变动脉对５－ＨＴ收缩反应增加的机制,观察要样硬化有关因子氧化低密度脂蛋白、低氧、５－ＨＴ对血管平滑肌细胞５－ＨＴ２Ａ受体及其基因表达,以及细胞「Ｃａ＾２＋」ｉ的效应。方法分别将大鼠主动脉平滑肌细胞单独以５０μｇ／ｍｌｏｘＬＤＬ培养８ｈ,２％,低氧处理２４和４８ｈ,１０μｍｏｌ／Ｌ５－ＨＴ处理３０ｍｉｎ,放射配基结合分析测定５－ＨＴ２Ａ受体;ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测受体     

噻庚啶抗内毒素休克的作用

目的　研究噻庚啶抗内毒素休克作用和机制.方法　静脉注射脂多糖(LPS) 5 mg/kg复制大鼠内毒素休克模型,Northern杂交分析TNFαmRNA表达,放免法测定血浆TNFα的含量,黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法测定血浆SOD活性,TBA法测定血浆MDA含量,激光扫描共聚焦显微技术测定单细胞内游离Ca2+浓度（［Ca2+i］）.结果　噻庚啶显著提高休克大鼠的平均动脉血压(MABP)及24 h的存活率,抑制LPS诱导的大鼠肝脏TNFα mRNA的表达这(18+10 vs LPS+saline 38±10, P<0.01)和血浆TNFα水平［（7.8±2.4)μg/L vs LPS+saline (21.5±3.2)μg/L,P<0.01)］,提高血浆SOD活性［（1037.2±112.8）NU/L vs LPS+saline (615.4±92.6)NU/L,P<0.01］,降低血浆MDA的含量［（5.2±1.1)μmol/L vs LPS+saline (9.8±1.5)μmol/L, P<0.01］,并能显著抑制TNFα诱导的内皮细胞［Ca2+］i升高.结论　噻庚啶通过抑制TNFα基因表达,抑制脂质过氧化和防止细胞内Ca2+超载具有良好的抗内毒素休克作用.     

线粒体KATP在吡那地尔预处理后失血性休克大鼠组织血流灌注和线粒体功能保护效应中的作用

目的 观察吡那地尔(pinacidil)预处理对失血性休克大鼠血流灌注和线粒体功能的保护效应,及其与线粒体ATP激活钾通道[adenosine triphosphate(ATP)-activated potassium channels,KATP]的关系.方法 Wiser大鼠60只,随机数字表法分为:正常对照组、休克组...     

Both Hypoxic Endothelial Cell Conditioned Medium and Hypoxia Elevate Intracellular Free Calcium in Pulmonary Artery Smooth Mu

ＢｏｔｈＨｙｐｏｘｉｃＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍａｎｄＨｙｐｏｘｉａＥｌｅｖａｔｅＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＦｒｅｅＣａｌｃｉｕｍｉｎＰｕｌｍｏｎａｒｙＡｒｔｅｒｙＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓＨＵＱｉｎｇ－...