荧光比率法测量平滑肌细胞内的钙动力学变化

目的 建立一种荧光比率方法来测量细胞内钙离子的动力学变化，并研究血管平滑肌细胞钙动力学变化在重症休克血管反应性降低中的作用。方法 复制SD大鼠失血性休克模型，分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)。使用荧光探针Fluo-3／AM、FuraRed双标记比率方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞钙动力学变化；评估荧光比率法在动态测定胞内钙离子浓度变化中的应用及其观察ATP敏感钾通道(KATP)特异性阻滞剂优降糖对血管反应性和钙动力学影响。结果 休克后2h(失代偿期1，血管反应性明显降低，NE作用带来的平滑肌细胞内钙离子浓度升高的程度明显减弱；加入优降糖可明显提高NE对平滑肌细胞内钙离子的升高作用，改善细动咏对NE的反应性，带来血管反应性部分恢复。在37℃，Flu-o-3／AM、FuraRed浓度为5μmol／L的条件下，肠系膜细动脉平滑肌细胞负载40min左右即可获得良好的标记效果。结论 优降糖特异性的阻滞ATP敏感钾通道的开放，增多细胞外钙内流并提高血管反应性；使用荧光比率法可以使胞内钙离子浓度的测量不受荧光探针浓度、细胞大小、激光漂白等因素的影响，可以准确、实时、动态测量细胞内钙离子浓度变化。     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca²⁺浓度的动力学变化,建立一种定量测量细胞内Ca²⁺浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞,用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca²⁺浓度的动力学变化;首先在37 ℃环境下标定Ca²⁺ 探针indo-1的解离常数Kd值,根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca²⁺ 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示,平滑肌细胞[Ca²⁺]_i 在地塞米松的刺激下显著上升,有时会出现自发钙波的现象,并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca²⁺]_i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化,不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca^2 浓度的动力学变化，建立一种定量测量细胞内Ca^2 浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞，用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca^2 浓度的动力学变化；首先在37℃环境下标定Ca^2 探针indo-1的解离常数Kd值，根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca^2 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示．平滑肌细胞[Ca^2 ]i在地塞米松的刺激下显著上升，有时会出现自发钙波的现象，并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca^2 ]i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化，不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

应用激光扫描散聚焦显微技术观察PDT导致癌细胞内钙水平的变化

目的 肿瘤光动力治疗（ＰＤＴ）是现代癌症治疗中一种新的治疗法,为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法 用Ｆｌｕｏ－３ＡＭ荧光探针负载培养的人肺腺癌ＧＬＣ８２细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内Ｃａ＾２＋浓度的变化。结果 激光单独照射前后ＧＬＣ－８２细胞内Ｃａ＾２＋的浓度变化不大;在ＰＤＴ作用下,激光照射前ＧＬＣ－８２细胞内ＣＡ＾２＋的浓度变化明显。结论 本方法灵敏、简单、快速,能     

一氧化氮合酶抑制剂对培养人分泌中期子宫内膜细胞内钙的影响

目的 观察已受雌、孕激素影响的人子宫内膜细胞在一氧化氮（NO）作用下的细胞生理变化。方法 取人分泌中期子宫内膜，体外原代培养24-48h，用钙荧光探剂Fluo-3-AM负荷钙离子，采用激光扫描共聚焦显微镜测定加入一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）后，子宫内膜细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2 ]i）的动态变化。结果 加入L-NAME后，腺上皮细胞和间质细胞[（Ca^2 ]i立即开始升高，400s后上升至高峰，900s时稍有下降，然后继续升高并保持在高水平，同时发现腺上皮细胞和基质细胞对L-NAME的反应不同。结论 在雌、孕激素作用的基础上，NO通过改变子宫内膜细胞[Ca^2 ]i进行信号转导，实现其生理效应。     

犬颅脑火器伤后细胞内钙变化的实验观察

目的：探讨犬颅脑火器伤后脑细胞内Ca^2 变化的规律。方法：建立犬脑枪弹伤致伤模型后，制备脑组织的活细胞悬液进行原代培养；应用特异性钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM标记，在激光扫描共聚焦显微镜下检测伤后不同时期、不同部位脑细胞内钙离子的分布情况。结果：培养得到了贴壁的犬颅脑火器伤后的脑组织活细胞。并观察到30min后细胞内Ca^2 即开始升高（P＜0．05），72h达到高峰（P＜0．01），78h后又呈下降的趋势（P＜0．05）；而挫伤区和震荡区的差别不大（P＞0．05）。结论：颅脑火器伤后细胞内Ca^2 的增加，在伤后的不同时期和不同部位的分布具有时空规律性，这可能是火器伤后脑水肿和一系列继发性脑损害的原因之一。     

应用激光扫描共聚焦显微技术观察PDT导致癌细胞内钙水平的变化

肿瘤光动力治疗 (photodynamictherapy ,PDT)是现代癌症治疗中一种新的治疗法 ,为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法 :用Fluo 3AM荧光探针负载培养的人肺腺癌GLC 82细胞 ,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内Ca2 浓度的变化。结果 :激光单独照射前后GLC 82细胞内Ca2 的浓度变化不大 ;在PDT作用下 ,激光照射前GLC 82细胞内Ca2 的浓度变化明显。结论 :本方法灵敏、简单、快速 ,能实时监测细胞内游离钙的变化。     

化疗药物诱导后乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化的检测

细胞内游离钙离子浓度的变化是导致细胞生理功能变化的重要物质基础,也是多种受体激动后信息传递过程的中心环节。2004年11月～2006年2月,我们对30例乳腺肿瘤组织细胞用五种化疗药物诱导后,采用激光扫描共聚焦显微镜检测乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化,并与常规MTT比色法的药敏结果比较,探讨使用激光扫描共聚焦显微镜检测化疗药物诱导后乳腺肿瘤细胞钙离子浓度变化的临床意义。     

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的　探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法　利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果　在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论　FRAP技术可以从功能上研究缝隙连接介导的细胞间通讯     

一氧化氮合酶抑制剂对培养的人分泌中期子宫内膜细胞内钙的影响

目的 观察已受雌、孕激素影响的人子宫内膜细胞在一氧化氮（NO）作用下的细胞生理变化。方法 取人分泌中期子宫内膜,体外原代培养24~48 h,用钙荧光探剂Fluo-3-AM 负荷钙离子,采用激光扫描共聚焦显微镜测定加入一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）后,子宫内膜细胞内游离钙离子浓度（［Ca2+］i）的动态变化。结果 加入L-NAME后,腺上皮细胞和间质细胞［Ca2+］i立即开始升高,400 s后上升至高峰,900 s时稍有下降,然后继续升高并保持在高水平。同时发现腺上皮细胞和基质细胞对L-NAME的反应不同。结论 在雌、孕激素作用的基础上,NO通过改变子宫内膜细胞［Ca2+］i进行信号转导,实现其生理效应。     

吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究

目的 研究吗啡对海马神经元游离子浓度([Ca^2 ]i)影响的机制，探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可能的治疗途径。方法 运用新型荧光探针Fluo-4 , 利用激光共聚焦显微镜研究吗啡对大鼠培养海马神经元[Ca^2 ]i作用机制。结果 10μmol/L吗啡急性刺激引起海马神经元[Ca^2 ]i升高，μ阿片受体选择性拮抗剂CTOP（1μmol/L）不能阻断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，δ2阿片受体选择性拮抗剂Naltrindole(1μmol/L）阻断了吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i反应，特异性的内质网钙泵抑制剂Thapsigargin(TG,1μmol/L）预处理海马神经元组断吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加，L－钙通道阻断剂Verapamil(20μmol/L）预处理海马神经元不能完全抑制吗啡引起的细胞内[Ca^2 ]i增加；100μmol/L吗啡长时程（24h）作用于海马神经元，细胞内[Ca^2 ]i升高，加入10μmol/L纳络酮急性戒断后，不能阻断细胞内[Ca^2 ]i升高，反而引起[Ca^2 ]i异常升高。结论 吗啡急性刺激引起的海马神经元内钙增加主要来源于δ2阿片受体介导的IP3敏感的钙库释放。     

钙超载大肠系膜血管平滑肌细胞钙离子稳态调节的改变

目的 探讨钙超载模型大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）胞内是否存在钙离子（Ｃａ＾２＋）稳态调节异常。方法 以Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ作为Ｃａ＾２＋批示剂,应用激光扫描共聚焦显微镜技术,比较钙超载模型大鼠肠系膜ＶＳＭＣ（ＣａＯＭＶ）与正常Ｗｉｓｔａｒ大鼠肠系膜ＶＳＭＣ（ＷＭＶ）静息态的胞浆与核内游离Ｃａ＾２＋水平（〖Ｃａ＾２＋〗ｉ,〖Ｃａ＾２＋〗ｎ）,以及在多各药物刺激下Ｃａ＾２＋稳态调节的差异。结果 两种Ｖ     

周期性张应变对椎间盘纤维环细胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨周期性张应变对培养的大鼠椎间盘纤维环细胞内Ca2 浓度([Ca2 ])的影响及其可能机制.方法采用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3/AM荧光探针标记技术,测定周期性张应变对纤维环细胞内[Ca2 ]的影响,并分析了EGTA、维拉帕米和氯化钆预处理对此作用的影响.结果应变为10%、频率为1 Hz的周期性张应变1 min使细胞内[Ca2 ]增加1.13倍;EGTA可以阻断此作用;而维拉帕米和氯化钆仅可部分阻断.结论周期性张应变使纤维环细胞内[Ca2 ]升高,细胞外钙内流起主要作用,且有不同的钙离子通道参与.     

The role of membrane potential and calcium kinetic changes in the pathogenesis of vascular hyporeactivity during severe shock

Objective To determine the role of membrane potential and intracellular calcium kinetic changes in producing vascular hyporeactivity during severe hemorrhagic shock.Methods Rats were subjected to hemorrhagic shock (HS) for 2 hours.The spinotrapezius muscle was prepared for microscopy and the responses of arterioles in the muscle to norepinephrine(NE) were tested.The resting membrane potentials of isolated arterial strips were measured with a microelectrode.Membrane potential and intracellular Ca(2+)(［Ca(2+)］i) changes in isolated arteriolar smooth muscle cells (ASMCs) were determined with fluorescent probes and a confocal microscopy. Results The arteriolar resting membrane potential was decreased from -36.7±6.3 mV in control to -29.2±5.3 mV concurrent with the increase of vasoreactivity to NE at 20 minutes after HS.At 120 minutes post-HS, the resting potential hyperpolarized to -51.9±9.1 mV, and NE stimulated ［Ca(2+)］i increase was reduced to 50% of the control values during the appearance of arteriolar hyporeactivity, i.e.the NE threshold of the arteriolar response increased 15 fold 2 hours after the onset of hemorrhage as compared with normal animals.The state of vasoreactivity was closely related to the resting potential of vascular smooth muscle in hemorrhagic shock, with a correlation coefficient of 0.96.Treatment with glybenclamide, a selective blocker of ATP-sensitive K(+)(K(ATP)) channels, decreased the resting potential, increased NE-stimulated［Ca(2+)］i increase, and partially restored vasoreactivity in severe hemorrhagic shock. Conclusion The results suggested that membrane hyperpolarization and the reduction of NE-stimulated ［Ca(2+)］i increase in smooth muscle cells appeared to contribute to the vascular hyporeactivity in hemorrhagic shock.The mechanism is likely to involve in K(ATP)channels.     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的 探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响。方法 应用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM将体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200 μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响。结果 与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性。结论 AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤。     

齐墩果酸对谷氨酸诱导神经细胞损伤的影响

目的 研究齐墩果酸(oleanolie acid,OA)对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的影响.方法 选用新生Wistar大鼠原代培养海马神经元,建立谷氨酸细胞毒性模型,借助于共聚焦显微镜结合钙荧光指示剂Fluo-3-AM观察OA对海马神经元[Ca2 ]i的影响.结果 1、10、100 μmol/L OA 谷氨酸组细胞内[Ca2 ]i均明显下降,与谷氨酸对照组相比[Ca2 ]i分别降低了0.32±0.05,0.41±0.06和0.43±0.09,差异均有显著性(P＜0.05).结论 OA可以降低谷氨酸诱导海马神经元[Ca2 ]i升高,对谷氨酸诱导的海马神经元损伤有一定的保护作用.     

葛根素对大鼠局灶性脑缺血后钙超载的保护作用

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血钙离子分布的时空变化及葛根素对钙超载的保护作用.方法 采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,在缺血后不同时间点应用葛根素进行干预,运用TTC染色观察脑梗死体积的变化.利用激光共聚焦显微镜观察局灶性脑缺血后不同时间点活脑片皮层及纹状体C矿的动态变化及其分布.结果 缺血后2 h组梗死侧皮层及纹状体C矿荧光强度均开始升高,并随缺血时间的延长而进一步增强(p＜0.001);假手术组皮层与纹状体Ca2+荧光强度无明显差异,而缺血后梗塞侧纹状体的Ca2+荧光强度明显高于皮层.与模型对照组各对应时间点相比,模型干预组2 h组、12 h组大鼠脑皮层和纹状体Ca2+荧光强度均明显下降.差异显著(p＜0.05),24 h组Ca2+荧光强度虽有所下降,但尚无统计学意义.结论 葛根素可能是通过减轻钙超载从而挽救半暗带,减小脑梗死体积.发挥神经保护作用的;12 h可能为葛根素治疗缺血性脑损伤的时间窗.     

褪黑素在叠氮钠所致的海马锥体细胞钙超载中的神经保护作用

目的 观察叠氮钠对急性分离的大鼠海马锥体神经元胞内游离钙的作用以及不同浓度的褪黑素（Melwatonin, MT)的影响。方法 海马锥体细胞的急性分离，新型游离钙荧光探针Fluo-4AM负载海马锥体细胞，激光共聚焦动态检测胞内游离钙的变化及叠氮钠，褪黑和荷包牡丹碱的作用。结果 在孵育液中加入叠氮钠（0.8mg/ml）能使急性分离的海马锥体细胞胞内游离钙在200s内急剧升高并维持在高水平，处于钙超载状态。褪黑素能使NaN3所致的海马锥体细胞内处于超载状态的游离钙显著下降，并有量效关系。结论 叠氮钠导致海马神经细胞损伤的早期原因可能是钙超载，MT促进钙离子向细胞外的转运而抑制叠氮钠所致的钙超载。