禽流感病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备及其特异性分析

为研制禽流感病毒(H5N1)非结构蛋白1(NS1)的特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性,本研究在分别表达了具有良好抗原性的A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白基础上,用A/Viet-nam/1194/04(H5N1)-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光和免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制实验对单抗识别的抗原位点进行分析。结果共获得19株能识别4个H5N1-NS1蛋白不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,5株为IgG2a、1株为IgG2b,另外13株为IgG1。这些mAb均与A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白特异性结合,免疫荧光检测均与A型流感病毒(H1N1和H3N2)有交叉反应,而与B型流感病毒无交叉现象。表明成功获得特异性针对H5N1-NS1蛋白的mAb,为进一步研究禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能奠定基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

骨桥蛋白单克隆抗体的制备及其特异性分析

为了研制骨桥蛋白(OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性。本研究在毕赤酵母中表达具有良好免疫原性的重组人OPN蛋白的基础上,用重组人骨桥蛋白(rhOPN)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选杂交瘤细胞,并结合免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别的抗原位点进行分析。结果共获得4株能够识别OPN不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,3株为IgG1,1株为IgG2a。这些mAb能与重组人OPN特异性结合。本研究的四株抗体中,只有4G2B5能够检出与肿瘤转移密切相关的OPN-c的条带,预示该抗体可用于判断肿瘤预后和高转移肿瘤的临床检测。本研究成功获得了针对骨桥蛋白的特异性mAb,同时为进一步研究OPN蛋白的结构和功能提供了重要工具。     

四种血清型登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)中和抗体的制备及鉴定

目的 制备四种血清型交叉反应性的登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(DENV-EDⅢ)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性及体外中和活性。方法 通过毕赤酵母表达具有良好抗原性的1～4型DENV-EDⅢ蛋白,并以四种DENV血清型EDⅢ蛋白混合免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇融合技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出稳定分泌抗DENV-EDⅢ抗体的杂交瘤细胞,进一步通过间接免疫荧光法对所获得mAb的特异性进行鉴定,并通过改良的酶联免疫斑点微中和实验对所获得的mAb进行体外中和活性测定。结果 获得6株特异性针对1～4型DENV-EDⅢ蛋白的mAb和11株特异性针对某一血清型DENV的EDⅢmAb,其中有1株mAb同时对四种血清型DENV有均衡的体外强中和活性,其对四种血清型DENV的半数抑制剂量(IC₅₀)分别为(0.05、 1.89、 0.02、 3.91)μg/mL。结论 成功筛选获得了一株可同时中和四种血清型DENV的EDⅢ特异性mAb。     

抗鸭坦布苏病毒非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体的制备

目的应用制备纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)非结构蛋白1(NS1),制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定抗体的特异性。方法将纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,聚乙二醇(PEG)处理小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,经ELISA筛选和亚克隆得2株NS1单克隆抗体细胞株,命名为NS1B、NS1E。利用ELISA测定NS1 mAb效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)鉴定NS1 mAb特异性,试剂盒测定NS1mAb亚类。最后,用NS1 mAb对感染DTMUV后6、12、24、36 h的BHK-21细胞进行IFA检测,观察NS1蛋白的表达。结果 NS1 mAb的亚型为IgG1,效价达到1∶1.28×10~4;表明制备的NS1 mAb能识别天然NS1蛋白;DTMUV感染BHK-21细胞12 h后NS1蛋白开始表达。结论获得2株具有反应性、特异性且效价高的NS1 mAb,可用于DTMUV感染检测。     

西尼罗病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的以西尼罗病毒非结构蛋白(nonstructural protein1,NS1)为免疫原制备西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法在表达具有良好抗原性的重组西尼罗病毒NS1蛋白基础上免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和免疫印迹对所获得单克隆抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对m Ab识别的抗原位点进行分析。结果获得39株特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,Ig亚类测定结果Ig G3和Ig G2a单抗各2株,Ig G2b单抗5株,Ig G单抗1株,另外29株均为Ig G1。结论成功获得了特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,将为进一步建立西尼罗病毒NS1抗原检测方法及探讨NS1蛋白及抗体在西尼罗病毒发病机制中提供依据。     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:研制鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人B7-H4分子的转基因细胞L929/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交技术,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选、多次克隆化培养,获得两株可特异分泌鼠抗人B7-H4分子mAb的杂交瘤细胞株。采用快速定性试纸分析法鉴定mAb所属的Ig亚类。用Dot-blot、Western blot鉴定mAb的特异性,竞争结合抑制实验鉴定mAb所识别的抗原结合位点,T细胞增殖抑制阻断实验对mAb的生物学功能进行初步的鉴定。结果:获得两株持续、稳定地分泌抗B7-H4 mAb的杂交瘤细胞,分别命名为1F10和2B2。Dot-blot的结果显示,两株mAb均能特异性识别B7-H4分子。Westernblot检测显示,mAb 2B2可以特异性识别B7-H4分子,而mAb 1F10则不能识别。位点竞争实验表明,两株mAb之间,mAb 1F10与商品化的mAb H74之间识别位点不同,mAb 2B2与商品化mAb识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断试验显示,这两株mAb均能一定程度地阻断B7-H4对T细胞的抑制作用。结论:成功地获得两株抗人B7-H4分子的mAb,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能提供了有效的工具。     

两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.

Abstract：

Objective To compare the humoral immune response of BALB/c mice immunized by recombinant plasmids PeDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1.Methods Dengue type 2 virus(DENV2)NS1 gene were constructed two partial sequences(1-413 bp)of the pcDNA3.1 eukaryotic plasmids and pET28a(+)plasmid for prokaryotic expression,identification,purification and quantification.The BALB/c mice were immunized by pcDNA3.1-M-NS1,pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmids with adjuvant.Each animal received a primary inoculation and two boosts at 1-week intervals.Then the blood samples of BALB/c mice were collected from different experiment groups at day 7,14,28 and 56,respectively after first immunization.The specific IgM/IgG antibodies for NS1 protein in serum were confirmed by indirect ELISA.And then the activities of the specific protective antibody were determined by cytopathic effect inhibition(CPEI).Results Construction of the pET28a(+)-NS1 m/pET28a(+)-NS1n prokaryotic expression plasmid,SDS-PAGE analysis showed that,NS1 gene partial sequence was expressed,both the relative molecular weight of about 22.3×103:Western blot showed that the protein can bind anti-His tag monoclonal antibody;byNi affinity chromatographywith apurity of 92% protein,on the C6/36 cell toxicity,and can be used ELASA detection.The results showed that the levels of specific IgM/IgG antibody and neutralizing antibody activities were increased in pcDNA3.1-M-NS1 booster immunization group than other groups.The result had been observed longer duration of antibody level in peDNA3.1-M-NS1 booster immunization group.Conclusion Humoral immune response were significantly different between pcDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmid immunized mice groups.     

一株识别CD83单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定

目的:鼠抗人CD83功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以人CD83转基因细胞L929/CD83为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0融合,以L929/CD83、293/CD83转基因细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用Ig类和亚类快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法、Western blot对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:获得1株稳定分泌鼠抗人CD83mAb的杂交瘤细胞株(命名为9D8),该mAb能特异性地识别成熟的DC、活化的T细胞及肿瘤细胞株Daudi、8226表达的CD83分子,该mAb识别的位点不同于商品化抗人CD83mAb(HB15e).结论:成功地研制1株鼠抗人CD83mAb,识别位点与HB15e不同,为更好地研究该分子的功能提供良好的物质基础.     

小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.     

登革病毒2型NS1蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察

目的　以登革病毒 2型 (denguevirus2 ,DV2 )非结构蛋白 (non structrulprotein 1,NS1)为靶基因 ,构建DV2 NS1的候选DNA疫苗 ;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法　将登革病毒 2型NS1 NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上 ,构建成重组体pCXN2 NS1 NS2a。在体外将重组质粒转染Cos 7细胞 ,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒 ,进行动物免疫实验。结果　重组质粒可在真核细胞中有效地表达NS1蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NS1蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生 ,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用 (antibody dependentcomple ment mediatedcytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示 ,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞变化情况 ,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比 ,CD4 + 、CD8+ 细胞水平有较大升高 (P <0 .0 1)。动物保护性实验结果显示 ,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时 ,有 6 6 .6 %的免疫鼠受到保护。结论　NS1 NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱     

Baculovirus-expressed nonstructural protein NS2 of bluetongue virus induces a cytotoxic T-cell response in mice which affords partial protection.

Virus-specific cytotoxic T lymphocytes were generated in two strains of mice (BALB/c and CBA/Ca) against baculovirus recombinant proteins (minor and nonstructural) derived from bluetongue virus serotype 10. Immunization of mice with recombinant baculovirus insect cell extracts expressing the nonstructural protein NS2 (Bac-NS2) conferred partial protection against infection with vaccinia virus expressing the NS2 protein. This protective immunity was mediated by CD8+ cells. In contrast, no protection was observed when mice were immunized with similarly expressed Bac-NS1 or -NS3 or the virion minor structural proteins (Bac-VP1, -VP4, or -VP6). Furthermore, the in vitro cytotoxicity activity of T cells derived from immunized animals did not correlate to the protective efficacy of baculovirus recombinant proteins. The implications of this work with regard to the design of noninfectious subunit vaccines are discussed.     

DNA vaccines against dengue virus based on the ns1 gene: the influence of different signal sequences on the protein expression and its correlation to the immune response elicited in mice

We analyzed four DNA vaccines based on DENV-2 NS1: pcENS1, encoding the C-terminal from E protein plus the NS1 region; pcENS1ANC, similar to pcENS1 plus the N-terminal sequence from NS2a (ANC); pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1; and pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 plus the ANC sequence. The NS1 was detected in lysates and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected cells and not in cells with pcTPANS1ANC. Only the pcENS1ANC leads the expression of NS1 in plasma membrane, confirming the importance of ANC sequence for targeting NS1 to cell surface. High levels of antibodies recognizing conformational epitopes of NS1 were induced in mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only few pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable anti-NS1 IgG. Protection against DENV-2 was verified in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice, although the plasmid pcTPANS1 induced slight higher protective immunity. These plasmids seem to activate distinct patterns of the immune system.     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

Characterization of monoclonal antibodies that specifically recognize the palm subdomain of hepatitis C virus nonstructural protein 5B polymerase

The nonstructural protein 5B (NS5B) of hepatitis C virus (HCV) is an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) which plays an essential role in viral RNA replication. Antibodies that specifically recognize NS5B will have utilities in monitoring NS5B production and subcellular localization, as well as in structure-function studies. In this report, three mouse monoclonal antibodies (mAbs), 16A9C9, 16D9A4 and 20A12C7, against a recombinant NS5B protein (genotype 1a, H-77 strain) were produced. These mAbs specifically recognize HCV NS5B, but not RdRps of polivirus (PV), bovine viral diarrhea virus (BVDV) or GB virus B (GBV-B). The mAbs can readily detect NS5B in cellular lysates of human osteosarcoma Saos2 cells constitutively expressing the nonstructural region of HCV (NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B). NS5B proteins of different HCV genotypes/subtypes (1a, 1b, 2a, 2c, 5a) showed varied affinity for these mAbs. Interestingly, the epitopes for the mAbs were mapped to the palm subdomain (amino acid 188-370) of the HCV RdRp as determined by immunoblotting analysis of a panel of HCV/GBV-B chimeric NS5B proteins. The binding site was mapped between amino acid 231 and 267 of NS5B for 16A9C9, and between 282 and 372 for 16D9A4 and 20A12C7. Furthermore, these mAbs showed no inhibitory effect on the NS5B polymerase activity in vitro.     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

Comprehensive mapping of immunodominant and conserved serotype- and group-specific B-cell epitopes of nonstructural protein 1 from dengue virus type 1

The dengue virus (DENV) nonstructural protein 1 (NS1) is an immunogenic protein that holds potential for the development of vaccines and diagnostic reagents; however, the epitopes of NS1 have not been comprehensively mapped. We mapped B-cell linear epitopes on NS1 using 149 monoclonal antibodies with DENV serotype specificity and cross-reactivity as well as antisera from 27 mice immunized with the four DENV serotypes. Epitope recognition analysis was performed using a set of 15-mer sequential overlapping peptides that spanned the entire NS1 protein from DENV-1. This strategy identified three regions of NS1 that are DENV-1 serotype-specific epitopes, namely amino acid residues 1-15, 71-85, and 338-352. We also identified five group-specific B-cell epitopes that were highly conserved among isolates of the four DENV serotypes. These novel immunodominant serotype- and group-specific B-cell epitopes of DENV NS1 may aid the development of new dengue vaccines and diagnostic assays.