绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立

目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×106 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.     

巨细胞病毒pp65抗原检测的新方法

目的传统的检测CMVpp65抗原的方法是间接免疫荧光,操作麻烦,步骤较多,整个实验需要6个多小时,而且只能定性。需要寻找一种简便的可以定量的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。因此我们设计了流式的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。方法我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行了流式标记移植病人外周血中的WBC,操作步骤明显简便了,只需不到2 h就可完成检测,而且可以定量检测CMVpp65抗原阳性细胞。同时我们用荧光定量PCR检测病人尿中的CMV基因的拷贝数。结果流式检测阳性率高的标本,用间接免疫荧光方法检测也为阳性,同时流式检测强阳性的病人尿用荧光定量PCR检测到CMV基因,表明病人处于CMV病毒血症。结论我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行流式标记,成功检测了移植病人的CMVpp65抗原阳性细胞的百分比,新方法可以定量,与荧光定量PCR方法检测病人尿中的CMV基因的结果符合率较高,可以推广应用。     

一株高滴度广谱抗HFRS病毒单克隆抗体的建立

本文用抗原上有些不同的肾综合征出血热(HFRS)病毒湖北毒株HA1018免疫BALB／c小鼠，与Sp2／0细胞融合，获得分泌抗HFRS单克隆抗体(MCAb)的杂交瘤E5细胞株。McAbE5为IgG1亚类，间接免疫荧光(IFA)测定腹水抗体滴度可达1：100万。     

流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展

细胞因子作为细胞间信号传导的分子, 主要介导和调节免疫应答及炎症反应, 刺激造血细胞生成和组织损伤的修复等。正常情况下, 细胞因子的表达和分泌受到机体严格地调控。在病理状态下, 细胞因子会出现异常表达。因此, 检测细胞因子对于某些疾病的诊断、治疗具有重要价值。当前,仅对细胞进行定量及活性检测已不能满足需要, 在单细胞水平研究细胞因子的表达更加重要。随着流式细胞术 (flowcytometry, FCM)在临床、科研中的广泛应用, 利用FCM与细胞内细胞因子 (intracellularcytokine, ICK)染色技术相结合,可提供一种有效地在单细胞水…     

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立

目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性;应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析;采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证;采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差;经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.     

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究

目的：建立一种高效﹑简便的荧光实时定量PCR方法，用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测。方法：利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒，收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后，提取病毒基因组DNA。以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒（bacmid）作为标准模板，进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线，然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板，采用同样体系进行实时PCR反应检测，同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果：成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝，病毒母液的DNA拷贝浓度（vg/mL）值约为空斑检测的滴度 pfu/mL值的10倍。结论：荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒，并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度，较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量。     

流式细胞术检测磷酸化STAT3

为建立流式细胞术检测细胞内的信号转导及转录活化因子 3 (STAT3 )的方法 ,用IL 5刺激HL 60细胞株 ,活化细胞内的STAT3 ,然后用抗酪氨酸磷酸化STAT3抗体及相应的二抗标记 ,进行流式分析。结果表明 :( 1)IL 5能活化HL 60细胞内的STAT3 ,且STAT3的酪氨酸磷酸化水平与IL 5的浓度之间存在剂量依赖关系 ;( 2 )可用流式细胞术测得的平均荧光强度反映细胞内酪氨酸磷酸化STAT3的相对浓度。应用流式细胞术能快速、定量地测定细胞内的磷酸化STAT3水平。本法可用于STAT3相关疾病的筛选和临床监测及对其他胞内信号转导分子的研究。     

流式细胞术检测HLA-B27及其临床意义

目的通过流式细胞术检测外周血白细胞HLA-B27的表达,并探讨其对强直性脊柱炎(AS)的诊断价值。方法利用流式细胞仪(FCM)检测41例AS患者、62例背痛及腰腿痛患者及112例健康体检者的外周血HLA-B27表达。结果 41例AS患者中,HLA阳性38例(92.6%);62例背痛腰腿痛患者中,HLA-B27阳性6例(9.67%);112例健康人群中,HLA-B27阳性2例(1.78%)。结论 AS患者HLA-B27阳性率明显增高,HLA-B27检测可视为临床支持AS诊断的重要依据。     

三色法流式细胞术检测胞内细胞因子的建立

运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗, 结合固定、破膜处理技术, 建立了三荧光染色法流式细胞术检测细胞内细胞因子的方法, 探讨了不同刺激剂及细胞培养时间的选择, 并对５ 例正常人产生ＩＦＮ γ、ＩＬ ４ 的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞进行测定。结果表明： 产生ＩＦＮ γ的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞明显多于产生ＩＬ ４ 的细胞, 并且产生ＩＦＮ γ的ＣＤ８ 细胞百分数比较ＣＤ４ 细胞相对增多; 同时产生ＩＦＮ γ／ＩＬ ４ 的ＣＤ４ 、ＣＤ８ 细胞较少。此方法可从单个细胞水平直接用于Ｔ细胞亚群及其细胞因子的检测。     

流式细胞术检测体内细胞毒效应方法的研究

目的 建立一种用流式细胞仪检测体内细胞毒效应的方法.方法 用不同浓度的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞和非靶细胞,以1:1的比例混合靶细胞和非靶细胞,尾静脉回输小鼠,16h后取小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检测CFSE标记靶细胞和非靶细胞的比例,测定体内被杀伤靶细胞的百分率.结果 荧光染料CFSE能有效标记靶细胞,16h后流式细胞仪能很好地检测到体内被杀伤靶细胞的百分率.结论 CFSE荧光染料标记靶细胞并结合流式细胞仪分析的方法能有效地检测到体内细胞毒效应,该技术有望在肿瘤免疫和移植排斥的体内监测中得到广泛应用.     

流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度

目的　建立一种流式细胞术 (FCM )快速检测抗生素最低抑菌浓度 (MIC)的方法 ,与常规药敏试验结果进行比较 ,探讨其应用价值。方法　取 2 0株肠杆菌科细菌 ,用碘化丙啶 (PI)染色 ,分别检测阴性对照管和MIC浓度抗生素作用管的平均荧光强度 (MFI) ,计算两者比值 ,据此 ,设定流式细胞药敏试验 (FCST)检测MIC的判断值 ,根据设定的判断值对 2 8株临床分离细菌同时进行常规药敏和FCST双盲测定。结果　 2 0株肠杆菌科细菌测得的MFI比值 x为 2 .0 7,CV为 0 .3 1;将MFI大于阴性对照细菌 2倍 (增加 10 0 % )的最低药物浓度定义为该菌的MIC ,2 8株临床菌株FCST所测得的MIC与常规药敏试验相比r=0 .92 ,(P <0 .0 0 1) ,回归方程为 :Y =1.4X -0 .48。结论　FCST与常规药敏试验结果有显著相关性 ,并且具有快速、稳定、准确、便于自动化等优点 ,有着较大的临床应用前景。     

医学研究生开设流式细胞检测术课程的初步探讨

流式细胞术（flow cytometry FCM）作为一门生物监测技术已得到广泛应用，涉及细胞生物学、分子生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、遗传学等方面，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、精度高、方法灵活等特点。流式细胞作为一项重要技术也成为研究生学习的重要内容，但目前在医学研究生教学中开展流式细胞检测技术课程的院校很少。本文就医学研究生开设流式细胞检测术课程的初步探讨。     

MTT法与流式细胞术检测肺炎合剂促进T淋巴细胞转化的实验研究

目的：探讨肺炎合剂对小鼠T淋巴细胞转化的影响，并试图为药研究淋巴细胞转化提供检测方法依据。方法：通过病毒性肺炎患儿淋巴细胞转化率降低的机体，用氢化可的松建立免疫低下小鼠模型，以不同剂量药液灌胃给药后，采用MTTI法和流式细胞仪检测法对比观察肺炎合剂对ConA诱导的小鼠脾T淋巴细胞转化的作用。结果：肺炎合剂使正常和免疫低下小鼠脾T淋巴细胞增殖能力显著增强。结论：肺炎合剂对小鼠脾T淋巴细胞增反应的促进作用，可能是该药作用机理之一。并认为流式细胞术是测定淋巴细胞转化的一种准确而可靠的方法。     

三色流式细胞术在检测人外周血CD4+CD25+CD62L+调节性T细胞的应用

随着流式细胞术(FCM)在淋巴细胞亚群分析及免疫状态分型技术领域的应用日益成熟,多参数FCM分析,已能区分不同的细胞亚群,由间接免疫荧光标记法,过渡到采用直接免疫荧光标记且从单色荧光发展到双色及多色荧光标记.     

流式细胞术检测细胞凋亡比较研究

从三方面探讨检测细胞凋亡流式细胞术的方法.选用大鼠皮质神经元细胞,同时使用碘化丙锭(PI)An-nexin V/PI.JC-1法检测细胞凋亡率.结果显示三种方法的凋亡率分别是:2.60%,6.52%和18.56%,两两之间有显著性差异(P＜0.01).JC-1法最敏感,AV/PI次之,PI单染法不适合检测早期细胞凋亡.     

三色流式细胞术检测全血中血小板活化

三色流式细胞术检测全血中活化血小板P 选择素的表达。采用双注射器筒采外周静脉血 ,枸橼酸钠抗凝。取 5 μl全血 ,加入 5 μlCD42a FITC、 5 μl6 2P PE、 5 μlCD45 CY ,室温避光 2 0min ,1%多聚甲醛固定 10min ,PBS洗后 ,上机分析。结果显示 ,全血三色法测定全血中血小板P 选择素表达阳性率明显低于富血小板血浆 (P <0 0 5 )。全血三色法测定全血中血小板P 选择素表达客观、特异、更接近人体生理情况。     

流式细胞术检测CD35表型对恶性肿瘤诊断的意义

目的:建立流式细胞术(FCM)检测恶性肿瘤患者血细胞上CD35分子表达的实验方法.方法:选择36例恶性肿瘤患者及25例健康人血标本,用流式细胞术(FCM)检测其红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞上CD35的表达.结果:恶性肿瘤患者红细胞、中性粒细胞、B琳巴细胞及CD4+T淋巴细胞上CD35的表达比健康人明显降低(P<0.01);而CD8+T淋巴细胞上CD35的表达比健康人明显升高(P<0.01).结论:建立了FCM检侧恶性肿瘤患者血细胞上CD35分子表达的实验方法.为恶性肿瘤的诊断、疗效观察及判断预后提供科学而先进的检测手段.     

全血法流式细胞术检测血小板相关抗体

目的:利用流式细胞仪(FCM)检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的血小板自身抗体,并与传统方法ELISA进行比较。方法:全血法FCM和ELISA分别检测46例ITP患者和20例正常人的血小板自身抗体。结果:FCM法快捷且灵敏度和准确度都高于ELISA。结论:FCM比ELISA更适合进行自身抗体检测。     

SFTS病毒、登革病毒、汉滩病毒快速荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

目的:建立针对发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)、登革病毒(dengue virus, DENV)、汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)三种常见病毒性出血热病毒的现场应急快速检测方法。方法:基于传统的T...     

流式细胞术检测肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群研究

目的 探讨肿瘤患者T淋巴细胞亚群的变化及临床意义。方法 采用流式细胞术检测27例肿瘤患者和25例正常对照组的T淋巴细胞亚群。结果 肿瘤患者CD3^＋T细胞、CD4^＋T细胞和CD4^＋／CD8^＋比值明显低于对照组并有统计学意义，而CD8^＋T细胞显著高于对照组（P〈0．01）。结论 肿瘤患者的免疫功能下降。流式细胞术对肿瘤患者的免疫功能的检测具有快速、敏感、准确的特点，对于评价疗效、判断预后具有重要价值。