汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初？…

目的 研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法 利用基因重组技术，构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫，用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体。结果 在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体。加强免疫后，抗体水平显著上升，免疫荧光抗体（ＩＦＡＴ）滴度最高达１：６４０。约８７％的免疫动物发生了血清抗体阳转。抗     

汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初步研究

目的研究汉滩病毒Ｓ片段编码区基因免疫小鼠的作用。方法利用基因重组技术,构建含汉滩病毒Ｓ片段编码区基因的真核表达质粒。用此质粒直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内进行ＤＮＡ免疫,用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体。结果在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体。加强免疫后,抗体水平显著上升,免疫荧光抗体（ＩＦＡＴ）滴度最高达１６４０。约８７％的免疫动物发生了血清抗体阳转。抗体水平及小鼠血清抗体阳转率与注射的质粒ＤＮＡ剂量及注射次数有关。结论应用基因免疫技术能够诱导机体产生针对汉滩病毒的特异性免疫应答     

汉滩病毒感染血管内皮细胞引起TLR4表达上调

目的 探讨汉滩病毒感染血管内皮细胞后,Toll样受体(TRY)分子的表达变化,为抗感染免疫和致病机制研究提供重要资料.方法 分别用LPS,CL097,Poly I:C以及汉滩病毒76-118刺激血管内皮细胞,6 h后提取总RNA,进行反转录获得cDNA,再分别用各自的引物进行PCR反应,产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,并用间接免疫荧光测定汉滩病毒感染血管内皮细胞后TLR4的表达.结果 汉滩病毒刺激感染后,血管内皮细胞TLR2、TLR4转录水平增高,TLR3转录水平降低,细胞膜表面的TLR4表达上调.结论汉滩病毒76-118感染血管内皮细胞后,可以引起TLRs分子转录水平发生改变,其中TLR4表达上调,固有免疫参与了汉滩病毒致病过程.     

汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保护作用的研究

目的建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型,以进行mAb的保护实验.方法将7～8wkBalb/c小鼠于感染病毒前1d及感染后1d,2d和4d,分别经腹腔注射环磷酰胺65mg/kg体重,总剂量为260mg/kg体重,观察其发病及死亡情况,并检测其体内不同脏器中汉滩病毒抗原的分布及滴度.用mAb对上述感染小鼠进行保护实验.结果经环磷酰胺处理的成龄鼠,由汉滩病毒隐性感染变为急性致死性感染(死亡率达100%).其发病症状与汉滩病毒感染的乳鼠类似,平均发病与死亡时间较感染乳鼠晚2～3d,且较为规律和集中.汉滩病毒抗原在感染的成龄鼠和乳鼠体内的分布及滴度基本相同.用mAb对感染的成龄鼠和乳鼠分别进行保护实验,结果完全一致.结论经环磷酰胺处理的成龄鼠,可作为汉滩病毒和HFRS研究用的动物模型.     

汉滩病毒感染HUVEC细胞系炎症介质表达的检测

目的 检测汉滩病毒陈株感染HUVEC细胞系ECV304中炎症介质的表达。方法 用汉滩病毒陈株感染HUVEC细胞系ECV304,取感染后不同时间的细胞提取细胞总RNA,用半定量RT－PCR检测感染细胞中ICAM－1、eNOS和IL－6基因的表达,并将扩增的ICAM－1和eNOS基因克隆,测定核苷酸序列。结果LACM－1的表达产物在病毒感染后较未感染细胞有明显升高,序列分析结果表明扩增的基因为特异性扩增产物;用扩增eNOS的引物从病毒感染细胞可扩增出表达产物,从未感染细胞不能扩增出任何产物,但序列分析结果表明扩增的基因与一新基因高度同源。结论 汉滩病毒陈株感染ECV304细胞可上调炎症某些介质的表达。     

TLR4介导汉滩病毒感染的血管内皮细胞转录因子NF-κB和IRF-3的细胞核移位

目的 观察汉滩病毒(HTNV)感染的TLR4基因沉默的EVC304细胞(TLR4~-EVC304)转录因子NF-κB和IRF-3的细胞核移位情况,为抗HTNV固有免疫及其信号转导研究提供新资料.方法 用汉滩病毒76-118株分别感染TLR4~-和TLR4~+EVC304细胞,同时以LPS作为阳性对照组,无任何刺激作为阴性对照组,6 h后用间接免疫荧光方法检测NF-κB和IRF-3的细胞核移位现象.结果 汉滩病毒76-118株刺激6 b后,在TLR4~+EVC304细胞中,NF-κB和IRF-3发生细胞核移位,而在TLR4~- EVC304细胞中未出现细胞核移位现象.结论 TLR4可能介导了HTNV感染的EVC304细胞中NF-κB和IRF-3的细胞核移位.     

抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因转化拟南芥的初步研究

目的:建立能表达抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的转基因植株,为汉坦病毒基因工程抗体的研究提供实验基础.方法:将构建的含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的植物抗体表达质粒3G1MH-pCAMBIA2301,用TSS冻融法导入农杆菌GV3101,利用农杆菌介导的抽真空转基因技术转化野生型拟南芥,获得转基因植株.用PCR、Northern blot检测转基因植株.结果:经PCR分析表明,拟南芥的基因组中有抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因整合,并成功获得7株T0代转基因拟南芥.植株提取RNA,经Northern blot分析可见约1 500 bp及800 bp处的目的条带,为编码重、轻链的目的基因.结论:成功地构建了含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的拟南芥植株,为进一步利用植物表达治疗性抗体奠定了基础.     

慢病毒介导的融合基因SP-TAT-Apoptin对HepG2细胞的作用

目的:将已构建的SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体包装成感染性慢病毒颗粒,并用病毒颗粒感染肝癌HepG2细胞,测定其诱导凋亡的效率。方法:通过脂质体Li-pofectamine TM2000将SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体与其他包装质粒共同转导入293FT细胞,包装并收集感染性病毒颗粒,用实时定量PCR法测定病毒滴度,免疫荧光法检测重组慢病毒感染的293FT细胞中SP-TAT-Apoptin融合基因的表达,同时通过流式细胞术(FCM)测定慢病毒感染后HepG2细胞的凋亡率。结果:SP-TAT-Apoptin重组慢病毒感染293FT细胞后,用V5抗原单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光化学检测,示SP-TAT-Apoptin融合基因可成功表达于293FT细胞;通过Anexin-VPI法检测示SP-TAT-Apoptin融合基因慢病毒感染肝癌HepG2细胞后可引起细胞凋亡,其凋亡效率明显高于单纯脂质体转染组。结论:成功包装出可表达SP-TAT-Apoptin融合基因且具感染性的慢病毒颗粒,感染HepG2肝癌细胞后可引起其凋亡,为进一步研究融合基因SP-TAT-Apoptin体内治疗效果极其在临床中的应用奠定了基础。     

汉滩病毒感染神经元细胞模型的建立

目的 利用体外培养的小鼠胚胎脑皮腩神经元，感染汉潍病毒（Ｈａｎｔａａｎ ｖｉｒｕｓ．ＨＴ－ＮＶ），建立病毒感染的神经元细胞模型，供探讨病毒感染神经元后细胞的变化及损伤机制之用。方法 将孕１６￣１９ｄ的昆明种小鼠胚胎皮质神经元正常培养存活后，感染汉滩病毒Ａ９株造成细胞损伤模型。使用间接免疫荧光方法检测神经元荧光抗体阳性情况；利用ＭＴＴ比色试验检测细胞存活情况；通过免疫组化方法观察神经细胞生长的情况。     

巨细胞病毒感染对细胞肾素基因表达的影响及其生物学意义

目的 探讨巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染肾球旁细胞肾素基因表达的变化及其意义.方法 用病毒感染复数(MOI)为10、0.1和0的鼠CMV分别与鼠肾球旁细胞模型As4.1细胞共育5 d作为实验组;用紫外线灭活病毒的假感染(mock感染)对照组.RT-PCR检测感染细胞中CMV即刻早期基因1(IE1)的表达;免疫荧光观察肾素阳性细胞和肾素阳性颗粒在细胞的分布;双色免疫荧光染色观察肾素阳性颗粒是否出现在CMV阳性细胞;RT-PCR和Western blot检测肾素基因在感染细胞内的表达.结果 CMV感染As4.1细胞后出现典型的病毒空斑;病毒感染细胞CMV IE1 RT-PCR产物阳性;肾素阳性细胞集中在病毒空斑周围CMV新感染细胞区,肾素阳性荧光颗粒主要以块状和环状存在于病毒感染细胞质中;双色免疫荧光染色显示肾素阳性颗粒和CMV阳性颗粒出现在同一细胞;CMV感染细胞肾素基因的表达随病毒感染量增加而增加.结论 CMV感染并导致其宿主细胞肾素基因表达,可能涉及CMV加速心血管疾病发生发展的新机制.     

巨细胞病毒感染对细胞肾素基因表达的影响及其生物学意义

目的 探讨巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染肾球旁细胞肾素基因表达的变化及其意义.方法 用病毒感染复数(MOI)为10、0.1和0的鼠CMV分别与鼠肾球旁细胞模型As4.1细胞共育5 d作为实验组;用紫外线灭活病毒的假感染(mock感染)对照组.RT-PCR检测感染细胞中CMV即刻早期基因1(IE1)的表达;免疫荧光观察肾素阳性细胞和肾素阳性颗粒在细胞的分布;双色免疫荧光染色观察肾素阳性颗粒是否出现在CMV阳性细胞;RT-PCR和Western blot检测肾素基因在感染细胞内的表达.结果 CMV感染As4.1细胞后出现典型的病毒空斑;病毒感染细胞CMV IE1 RT-PCR产物阳性;肾素阳性细胞集中在病毒空斑周围CMV新感染细胞区,肾素阳性荧光颗粒主要以块状和环状存在于病毒感染细胞质中;双色免疫荧光染色显示肾素阳性颗粒和CMV阳性颗粒出现在同一细胞;CMV感染细胞肾素基因的表达随病毒感染量增加而增加.结论 CMV感染并导致其宿主细胞肾素基因表达,可能涉及CMV加速心血管疾病发生发展的新机制.     

中和试验发现西安地区为肾综合征出血热混合型疫区

目的 调查陕西西安地区汉坦病毒感染现状,分析当地肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫源地性质.方法 根据HFRS发病报告数据,分析西安HFRS的发病特点.通过荧光定量RT-PCR方法,检测西安HFRS疫区家鼠和野鼠携带汉坦病毒情况及病毒型别.微量中和试验确定西安本地HFRS病人、HFRS疫苗接种者和隐性感染者血清中的汉坦病毒中和抗体水平并分型,回顾性调查阳性感染者.结果 西安地区HFRS发病每年均有6-7月份的小高峰和10-12月份的大高峰;在当地642只家鼠和1 546只野鼠肺组织中检出汉滩病毒RNA136份;143份人血清中123份检测到汉坦病毒中和抗体,未检测到中和抗体的有20份.中和抗体阳性者中判定为汉滩病毒感染者92人,占74.80％;判定为汉城病毒感染者3人,占2.44％;不能区分病毒感染型别者28人,占22.76％,3例感染汉城病毒者分别为HFRS病人、疫苗接种者和隐性感染者,调查显示3例均为本地感染.结论 实验室和现场调查证实当地存在汉城型病毒本地感染,陕西西安地区是以汉滩病毒型为绝对优势的HFRS混合型疫区.     

汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价

目的：研究汉滩病毒（HTNV）囊膜糖蛋白G1与核蛋白（NP）部分片段在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学特性，为HTNV基因工程疫苗的研制提供依据。方法：构建含有HTNV G1S0.7嵌合基因的重组杆状病毒Bac-G1S0.7，用其感染的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠。用间接免疫荧光法、ELISA法、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验对被免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果：Bac-G1S0.7感染的昆虫细胞免疫小鼠后，测得免疫鼠血清抗HTNV抗体滴度最高达1：3200，含有特异性抗HTNV NP及抗HTNV糖蛋白G1的抗体，被免疫小鼠中有部分产生了较低滴度的中和抗体，免疫鼠脾细胞对HTNVNP或糖蛋白的增殖反应指数均高于阴性对照组。结论：G1S.07嵌合基因的昆虫细胞表达产物具有较好的免疫原性，可刺激机体同时产生针对HTNV NP与囊膜糖蛋白G1的细胞及体液免疫应答。     

抗核抗体谱检测的临床诊断意义

目的:分析抗核抗体线性免疫印迹分析法( ANA-LIA)和抗核抗体间接免疫荧光法在自身免疫性疾病临床的诊断价值.方法:ANA-LIA使用德国IMTEC公司IMTEC-Human GmbH抗核抗体谱试剂检测；抗核抗体用间接免疫荧光法检测.结果:用间接免疫荧光法检测抗核抗体300例,用免疫印迹法检测抗核抗体谱263例,ANA荧光法与ANA-LIA免疫印迹法检测阳性结果无显著性差异(P＞0.05)；30例同时进行ANA、ANA-LIA检测,结果一致率73.3％；ANA-LIA漏检率20％,错检率6.7％.结论:以间接免疫荧光法检测抗核抗体缺乏特异性,而抗核抗体谱免疫印迹法具有高特异性,但存在着较高的漏检率,因此在临床实际应用中将两种方法联合应用,检测效果更好.     

抗汉滩病毒 NP抗原 mAb的 ScFv－ Cκ基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的构建抗汉滩病毒(HTNV)NP抗原mAb的ScFv-Cκ基因原核和真核表达载体。方法将鼠源性抗HTNVmAb1A8的ScFv基因和人Cκ基因连接,分别克隆入原核表达载体pComb3和真核表达载体pCI-neo中,并用间接免疫荧光和Western-blot检测其原核表达产物的活性。结果成功地构建了重组1A8-ScFv-Cκ基因并克隆入原核和真核表达载体。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,该基因在E.coliTG1中的表达产物可与HTNVNP抗原特异性结合。结论抗NP抗原mAb的ScFv-Cκ原核和真核表达载体的构建,为进一步研究细胞内抗体的功能奠定了基础。     

儿童EB病毒抗体检测与EB病毒感染相关疾病的临床分析

目的:探讨EB病毒(EBV)抗体检测在儿童EB病毒相关疾病中的意义.方法:应用间接免疫荧光法检测120例病例的EBV特异性抗体及抗体亲合力.结果:在120例儿童EBV感染患儿中,以血液系统疾病为多,其次是心血管、呼吸、消化系统疾病;入院时血清EBV抗体反应存在多种类型,抗EBV-CA-IgM阳性率达90.8%,随着时间...     

猪PCV2 ORF2蛋白I-ELISA检测方法的建立及猪场血清抗体检测分析

目的用猪PCV2 ORF2蛋白建立ELISA检测方法 ,有效区分猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2),并进行大规模化样本检测。方法以猪PCV2 ORF2蛋白作为包被抗原,以抗PCV2阳性血清为一抗,羊抗猪酶标物为二抗,通过预试验确定诱导温度、诱导时间、摇动转速、IPTG浓度以及反应板种类等参数,从而建立间接酶联免疫吸附方法(I-ELISA)以检测抗PCV2猪血清抗体滴度。结果采用本研究建立的ELISA方法测定山东省内4个猪场送检的316份猪血清,检出PCV2阳性率处于较高水平,表明猪群携带病毒比例很高。结论本试验建立的间接ELISA检测方法敏感度高、特异性强,可用于临床PCV2血清抗体的检测,为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PCV2感染的快速诊断方法提供了科学依据。     

巨细胞病毒pp65抗原检测的新方法

目的传统的检测CMVpp65抗原的方法是间接免疫荧光,操作麻烦,步骤较多,整个实验需要6个多小时,而且只能定性。需要寻找一种简便的可以定量的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。因此我们设计了流式的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。方法我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行了流式标记移植病人外周血中的WBC,操作步骤明显简便了,只需不到2 h就可完成检测,而且可以定量检测CMVpp65抗原阳性细胞。同时我们用荧光定量PCR检测病人尿中的CMV基因的拷贝数。结果流式检测阳性率高的标本,用间接免疫荧光方法检测也为阳性,同时流式检测强阳性的病人尿用荧光定量PCR检测到CMV基因,表明病人处于CMV病毒血症。结论我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行流式标记,成功检测了移植病人的CMVpp65抗原阳性细胞的百分比,新方法可以定量,与荧光定量PCR方法检测病人尿中的CMV基因的结果符合率较高,可以推广应用。     

银强化滴金免疫法检测肾综合征出血热IgM的研究

目的 建立一种检测血清汉滩病毒抗体ＩｇＭ的方法。方法 将汉滩病毒抗原点于硝基纤维膜上,应用Φ１５ｎｍ的羊抗人ＩｇＭ金标抗体与血清标本中的汉滩病毒ＩｇＭ结合,再加银加强试剂,阳性者为棕黑色。结果 整个试验过程需要１０ｍｉｎ,用该法与ＥＬＩＳＡ法对比检测临床标本,结果有良好的一致性,总符合率为９８％。结论 银强化滴金免疫法操作简单,试剂稳定、安全、敏感、快速,适于基层。     

汉滩病毒囊膜蛋白及核壳蛋白与免疫保护力的关系

目的 为了阐明汉滩病毒囊膜蛋白及核壳蛋白与免疫保护力的关系。方法 采用区带离心及柱层析纯化汉滩病毒LR1株囊膜蛋白（GP）和核壳蛋白（NP），以GP、NP和GP＋NP分别免疫家兔，测定其中和抗体和保护力。结果 实验显示，GP和GP＋NP免疫组家兔血清中和抗体滴度≥1：10，NP免疫组家兔血清中和抗体≤1:5;而保护性试验显示，GP、NP、GP＋NP免疫组家兔均可保护100ID50同株病毒的攻击。结论 上述结果表明，汉滩病毒GP和NP组份均与其保护力有关。