茯苓对裸鼠SGC-7901胃癌细胞移植瘤的影响

目的研究中药茯苓对SGC-7901胃癌细胞株裸鼠体内移植瘤的影响。方法 1将10只裸鼠建立移植瘤模型后,随机分为空白对照组和茯苓组,每组5只,分别给予生理盐水和茯苓灌胃(0.5 mL),连续灌胃32 d。每间隔3 d计算移植瘤的体积,绘制移植瘤生长曲线。至第32天时处死裸鼠,称取瘤体重量,计算抑瘤率;同时采用免疫组化染色方法检测2组裸鼠移植瘤组织中B细胞淋巴瘤基因-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。2制备含茯苓血清。将SGC-7901胃癌细胞株分为2组,空白对照组加入含生理盐水血清,茯苓组加入含茯苓血清的培养液培养。分别于处理后24 h和48 h行Western-blot法检测胃癌细胞中Bcl-2及Bax的表达。结果第32天时,空白对照组〔(2 652.17±225.01)mm3和(2.48±0.21)g〕裸鼠的移植瘤体积和质量均大于茯苓组〔(1 247.56±277.23)mm~3和(1.28±0.28)g〕,差异均具有统计学意义(P0.050)。茯苓的抑瘤率为48.39%。免疫组化检测结果显示,茯苓组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2〔(4.20±1.10)分和(8.00±1.20)分〕和VEGF〔(3.80±0.45)分和(7.80±1.10)分〕的表达均低于空白对照组(P0.050),而Bax〔(7.40±1.34)分和(3.00±0.71)分〕、Caspase-3〔(6.60±1.34)分和(2.60±0.55)分〕及Caspase-9〔(7.20±1.79)分和(4.00±1.22)分〕的表达均高于空白对照组(P0.050)。与空白对照组(1.72±0.03)比较,24 h(0.96±0.04)和48 h(0.77±0.04)时茯苓组Bcl-2的表达水平均较高(P0.050),且茯苓组48 h时Bcl-2的表达水平高于24 h时(P0.050);与空白对照组(0.15±0.01)比较,24 h时(0.19±0)茯苓组Bax的表达水平变化不明显(P0.050),但48 h时(0.55±0.01)Bax的表达水平高于空白对照组和24 h茯苓组(P0.050)。结论茯苓能够抑制裸鼠移植瘤的生长,其机理可能与线粒体凋亡通路及抑制VEGF的表达有关。     

抗原致敏树突细胞增强细胞因子诱导杀伤细胞抗胃癌的效应

目的 观察抗原致敏树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养体内外抗胃癌(SCC-7901)的效应.方法 取健康供者外周血体外诱导培养DC和CIK,应用噻唑蓝(MTT)法测定比较(每组n=3)单纯CIK(CIK组)、DC诱导CIK(DC-CIK组)和经胃癌抗原致敏的DC诱导CIK(抗原-DC-CIK组)体外对SGC-7901的杀伤活性,并利用SGC-7901建立胃癌裸鼠模型,设立PBS对照组,比较各组(每组n=5)瘤体体积、抑瘤率和肿瘤坏死面积评分.结果 成熟DC与CIK共培养第7天时,DC-CIK扩增倍数为17.8±2.0,约为单纯CIK扩增倍数(10.9±1.8)的1.63倍(P＜0.05);抗原-DC-CIK组、DC-CIK组、CIK组,体外实验中效靶比为20:1时对SGC-7901的杀伤活性分别为:(72.3±0.5)%、(53.9±0.7)%、(46.4±0.4)%(P均＜0.01);体内动物实验中抑瘤率分别为30.02%、18.11%、15.94%(P均＜0.01).结论 SGC-7901抗原致敏DC能增加CIK的扩增数量,增强CIK对SGC-7901的杀伤作用.     

反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞抗肝癌免疫作用

目的探讨反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞(DC)后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌作用。方法采用细胞培养方法,从小鼠骨髓中获得DC,用反义IDO核酸和AFP基因融合的载体,转染入DC内,检测转染入融合基因DC的对T细胞增殖的影响和体外对肝细胞癌的免疫应答的改变。以~(51)Cr释放法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。制作小鼠肝癌模型,分别予以反义IDO-AFP修饰的DC、单纯DC、空白对照组进行治疗,检测血清中自细胞介素(IL)-10、干扰素(IFN)-7水平；CD4、CD8和IFN-7和IL-10双阳性细胞比例,观察其抑制肿瘤的效果。结果反义IDO-AFP修饰的DC可激活小鼠脾淋巴细胞；能对肝癌细胞株H22细胞进行特异性杀伤,杀伤率为89．3%,显著高于单纯DC、生理盐水(空白对照组)组的34．7%和8．9% (P均＜0．01)而对艾氏腹水瘤细胞无效；反义IDO-AFP修饰DC组色氨酸含量为(17．8±1．2)μm,而单纯DC组和空白对照组的色氨酸为(6．2±0．6),um和(5．2±1．2)μm,表明反义IDO-AFP修饰DC可明显增加培养液中的色氨酸。使Thl细胞比例上升,抑制体内肿瘤的生长。结论反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌的目的,可成为一种有效的瘤苗。     

精准肝切除在肝胆管结石病的临床应用

目的评价精准肝切除术在治疗肝胆管结石病中的作用,为肝切除治疗肝胆管结石病提供新的理念。方法回顾性比较分析132例精准肝切除与52例非规则性肝切除治疗肝胆管结石病在手术时间、术中出血量、术后并发症、住院时间、结石清除率和住院费用方面的差异。结果尽管精准肝切除组患者手术时间〔(364.6±57.8)min〕长于非规则性肝切除组〔(292.9±44.7)min〕,P<0.001,但其术中出血量〔(558.3±90.6)ml〕明显少于非规则性肝切除组〔(726.7±88.7)ml〕,P<0.001,术后并发症明显更少(11.4%比23.1%,P=0.004 3),结石清除率更高(89.4%比73.1%,P=0.005 5)。同样,精准肝切除组患者住院时间〔(22.9±4.4)d〕短于非规则性肝切除组〔(28.8±3.5)d〕,P<0.001,住院费用〔(1.8±0.7)×104元〕也少于非规则性肝切除组〔(2.1±0.9)×104元〕,P=0.016 5。结论精准肝切除治疗肝胆管结石病优于非规则性肝切除术。     

完全腹腔镜与腹腔镜辅助胃癌根治术近期临床疗效的对比研究

目的比较完全腹腔镜胃癌根治术与传统腹腔镜辅助胃癌根治术的临床疗效,探讨全腹腔镜下吻合技术在腹腔镜胃癌根治术中的安全性及可行性。方法回顾性分析2013年1月至2014年3月期间我科64例行完全腹腔镜胃癌根治术(全腔镜组)和70例行传统腹腔镜辅助胃癌根治术(腔镜辅助组)患者的临床资料。结果134例手术均获成功,无一例中转开腹。与腔镜辅助组相比,全腔镜组的吻合时间〔(73.8±10.3)min比(72.7±8.9)min,t=0.693,P=0.489〕和清扫淋巴结数〔(32.4±9.7)枚比(33.6±9.6)枚,t=-0.700,P=0.485〕差异均无统计学意义,但术中出血量〔(275.0±66.3)m L比(364.3±75.7)m L,t=-7.419,P=0.000〕明显减少,切口长度〔(3.0±0.8)cm比(7.3±1.7)cm,t=-19.354,P=0.000〕明显减小、进食流质时间〔(4.9±0.8)d比(6.0±0.7)d,t=-8.750,P=0.000〕、肛门排气时间〔(2.8±0.8)d比(3.9±0.8)d,t=-8.388,P=0.000〕、下床活动时间〔(1.3±0.5)d比(3.4±1.2)d,t=-14.118,P=0.000〕、住院时间〔(9.8±1.2)d比(13.0±1.5)d,t=-17.471,P=0.000〕明显缩短,且术后患者的疼痛评分〔术后第1 d:(3.4±0.8)分比(6.2±1.3)分,t=-15.509,P=0.000;术后第3 d:〔(1.7±0.6)分比(4.0±0.8)分,t=-18.799,P=0.000〕明显降低和需要的止痛剂剂量〔(1.7±0.7)支比(4.0±2.1)支,t=-8.912,P=0.000〕明显减少。腔镜辅助组出现吻合口漏1例,出现吻合口狭窄3例,吻合口相关并发症发生率为5.7%(4/70)。全腔镜组均未出现吻合口漏、吻合口狭窄或吻合口出血等吻合口相关并发症。结论完全腹腔镜下吻合技术在腹腔镜胃癌根治术中安全、可行,与小切口辅助吻合相比具有创伤小、出血少、恢复快、住院时间短、疼痛感轻等优势,近期效果显著。     

420例经胸乳入路全腔镜下甲状腺手术体会

目的探讨经胸乳入路全腔镜甲状腺手术的临床应用意义。方法对我院2008年9月至2015年9月期间收治的符合纳入标准的890例甲状腺疾病患者的临床资料进行回顾性分析,根据手术方式分为经胸乳入路全腔镜下甲状腺手术组(简称"全腔镜组",n=420)和行传统开放甲状腺手术(简称"传统组",n=470)2组,比较2组患者的手术情况及术后恢复情况。结果全腔镜组和传统组患者的手术时间〔(73.571 4±28.533 9)min比(70.212 8±27.199 8)min,t=1.80,P=0.072 7〕、术中出血量〔(30.714 3±14.225 1)m L比(29.106 4±13.559 1)m L,t=1.73,P=0.084 8〕、术后引流量〔(60.000 0±27.287 9)m L比(56.595 7±27.803 5)m L,t=1.84,P=0.066 2〕、术后住院时间〔(5.333 3±1.085 1)d比(5.446 8±1.089 0)d,t=1.55,P=0.120 4〕、术后24 h疼痛评分〔(5.333 3±2.308 7)分比(5.404 3±2.182 1)分,t=0.47,P=0.637 8〕、喉返神经损伤率〔0.714 2%(3/420)比0.851 1%(4/470),x2=0.053 2,P=0.817 6〕、术后暂时性甲状旁腺功能减退率〔0.476 2%(2/420)比0.851 1%(4/470),x2=0.465 5,P=0.495 1〕比较,差异均无统计学意义,但全腔镜组的术后7 d切口美容效果评分明显高于传统组〔(7.809 5±1.296 9)分比(3.361 7±1.391 8)分,t=49.14,P0.000 1〕。结论经胸乳入路全腔镜甲状腺手术安全、效果可靠,能显著提高患者的美容效果。     

自体负载肿瘤抗原树突状细胞治疗大鼠甲状腺癌

目的 观察自体负载肿瘤抗原树突状细胞(DC)对大鼠甲状腺癌的治疗作用.方法 建立Wistar荷瘤大鼠动物模型,随机分为治疗组和对照组,治疗组静脉输入负载肿瘤抗原DC、对照组输入生理盐水,检测分析2组血清中自细胞介素(IL)-12、IL-8表达水平,以及瘤重、瘤体体积及大鼠存活.结果 治疗组与对照组瘤重、瘤体体积、存活期、IL-12及IL-8表达水平分别为:(3.56±0.79)g比(4.97±0.56)g、(3.98±0.84)cm3比(5.06±0.58)cm3、(36.0±3.0)d比(28.0±3.2)d、(368.9±21.7)ng/L比(227.7±13.4)ng/L和(218.9±19.3)ng/L比(371.2±24.1)ng/L(P值分别<0.01、<0.01、<0.05、<0.01、<0.01).结论 自体负载肿瘤抗原DC对甲状腺癌具有较好的抑瘤效应,可延长荷瘤鼠的生存期.     

直肠癌组织中肿瘤浸润性树突状细胞数量和表型的改变及临床意义

目的:探讨直肠癌组织中肿瘤浸润性树突状细胞数量和表型的改变及临床意义。方法:前瞻性收集直肠癌患者50例作为观察组,同期收集直肠良性肿块50例作为对照组,手术切除后,检测组织中肿瘤浸润性树突状细胞数量和表型,分析两组差异;同时分析直肠癌组织中肿瘤浸润性树突状细胞数量、表型与患者临床病理特征的相关性。结果:观察组直肠癌组织中肿瘤浸润性树突状细胞密度明显低于对照组([8.17±2.42) vs.(9.65±2.28),P=0.002]、MHC-Ⅱ阳性DC(%)和CD54阳性DC(%)亦均低于对照组([6.65±2.42)%vs.(9.49±2.48)%,P=0.000]和[(7.49±2.33)%vs.(9.82±2.52)%,P=0.000]。TNM分期Ⅲ者肿瘤浸润性树突状细胞密度低于Ⅰ、Ⅱ期者[(7.60±1.73)vs.(8.55±1.47),P=0.042]、MHC-Ⅱ阳性DC百分比及CD54阳性DC百分比亦均低于Ⅰ、Ⅱ期者[(5.41±1.82)%vs.(7.48±1.94)%,P=0.000;(6.68±2.02)%vs.(8.03±1.97)%,P=0.023]。肿瘤最大直径≥5 cm者肿瘤浸润性树突状细胞密度低于肿瘤最大直径5 cm者[(7.12±1.89)vs.(9.06±2.01),P=0.001]、MHC-Ⅱ阳性DC百分比及CD54阳性DC百分比亦低于肿瘤最大直径5 cm者[(5.41±1.91)%vs.(7.71±1.88)%,P=0.000;(6.32±2.02)%vs.(8.49±1.94)%,P=0.023]。结论:肿瘤浸润性树突状细胞在直肠癌组织中低表达,不成熟细胞比例增加,与TNM分期和肿瘤直径有关。     

大鼠胰腺癌微环境诱导未成熟树突状细胞功能的变化

目的 观察胰腺癌微环境对树突状细胞(DC)成熟的影响及功能变化并探讨胰腺肿瘤细胞免疫逃逸的机制.方法 培养树突状细胞,加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)40μg/L、白细胞介素(IL)-4 40μg/L,培养到第6天时得到大量的未成熟树突状细胞(imDC),加入大鼠胰腺癌细胞(AR42J cell)培养上清液诱导,流式细胞术检测DC的表面分子CD86、CD80的表达(n=6),观察能否延缓或阻断imDC的成熟及其在脂多糖(LPS)刺激后这种作用能否被逆转.并观察AR42J细胞培养上清诱导的Dc对同种异体混合淋巴细胞增殖.结果 加入胰腺癌癌细胞上清液培养的DC,与正常成熟的DC比较,CD80+CD86+阳性率由(70.88±3.60)%降至(7.15±0.71)%,LPS刺激后DC细胞的表面分子CD80+CD86+表达仍然较低(7.43±1.05)%,表明胰腺癌细胞培养上清液对DC的成熟有阻断作用.AR42J细胞上清诱导培养的imDC组刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的强度显著低于正常培养的imDC组刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的强度.结论 体外大鼠胰腺癌细胞培养上清液可以诱导DC处于不成熟状态,且这种不成熟状态不容易被逆转.     

负向免疫调节树突状细胞对心脏移植大鼠免疫状态的影响

目的 探讨经体外光化学法(PUVA)处理的供者脾淋巴细胞与受者树突状细胞(DC)共培养后,对移植受者体液免疫、细胞免疫及移植物排斥反应的影响.方法 以DA大鼠为供者,LEW大鼠为受者,建立大鼠腹部异位心脏移植模型.分离供者脾淋巴细胞(SP),制备经PUVA处理的供者脾淋巴细胞(PUVA-SP).在体外分别将供者PUVA-SP和SP与受者骨髓来源的未成熟DC共培养,得到PUVA-SP-DC及SP-DC,流式细胞仪检测上述DC表型.根据受者心脏移植术前1周静脉输注成分的不同,将受者随机分为3组:(1)对照组(n=7):单纯输注磷酸盐缓冲液(PBS);(2)SP-DC组(n=8):输注Sp-DC 5×106个;(3)PUVA-SP-DC组(n=8):输注PUVA-SP-DC 5×106个.每日观察各组移植心的存活状况.移植后第6天,检测受者血清中抗供者特异性IgG水平;通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测受者脾脏T淋巴细胞对供者抗原刺激的增殖反应;比较各组受者脾脏体积的大小.结果 供者脾淋巴细胞经PUVA处理后细胞凋亡率为81.93%.正常LEW大鼠DC共刺激分子CD80和CD86阳性率分别为(3.5±0.27)%和(13.0±0.58)%,受者DC与供者SP混合培养后,其CD80和CD86的表达水平为(16.6±0.72)%和(36.5±0.87)%,后者明显高于前者(P<0.01);受者DC与供者PUVA-SP混合培养后,其CD86和CD80的表达率分别为(3.9±0.12)%和(13.4±0.59)%,与正常LEW大鼠DC相当(P>0.05).PUVA-SP-DC组的受者抗供者特异性IgG水平明显低于SP-DC组及对照组(P<0.01).PUVA-SP-DC组受者T淋巴细胞对供者抗原的刺激反应指数为1.66±0.29,明显低于SP-DC及对照组(7.28±0.38、4.19±0.16,P<0.01);而其对无关供者抗原的刺激反应指数为4.37±0.11,与SP-DC及对照组相当(4.51±0.40、4.36±0.14,P>0.05).PUVA-SP-DC组的移植心存活时间比其他两组明显延长(P<0.01),而且其脾脏体积最小.结论 PUVA-SP-DC能够特异性的下调移植受者对供者抗原的细胞免疫及体液免疫反应,从而明显延长移植物存活时间.     

细胞在胶原复合薇乔网片的吸附研究

目的骨髓细胞、软骨细胞、韧带细胞和滑膜细胞在胶原合成的薇乔网片上培养,研究四种细胞的吸附率。方法细胞在含血清和无血清培养液中,不同的细胞浓度,培养30min和6h,收集未吸附的细胞,统计吸附在合成后的薇乔网片上的细胞吸附率。结果骨髓细胞、软骨细胞、韧带细胞和滑膜细胞在血清和无血清培养液中都可以吸附在胶原复合的薇乔网片上。结论胶原合成的薇乔网片用于组织工程时,应该根据不同的细胞采用不同的培养条件。     

Mast Cells and Dendritic Cells in Basal Cell Carcinoma Stroma

Background. The interaction of tumors with the surrounding stroma has become an important topic in tumor biology. Basal cell carcinoma (BCC) stroma has been characterized as hypervascular and rich in mast cells. The presence of dermal dendrocytes thought to have both antigen presenting and wound healing functions has recently been reported in BCC stroma. GP1b-α is a newly described vascular adhesion molecule with potential significance in tumor biology.
Objective. To further characterize the cellular phenotype of BCC stroma.
Methods. Eleven BCCs (8 nodular, 2 sclerosing, 1 adenoid-cystic) were examined using immunohistochemical techniques for the presence of antigens specific to vascular endothelium, mast cells, and dermal dendrocytes.
Results. The stroma of all BCCs demonstrated increased vascularity, increased numbers of mast cells, and increased numbers of dermal dendrocytes expressing both CD34 and GP1b-α adjacent to tumor nests. No differences in antigen expression were observed between histologic subtypes of BCC.
Conclusion. The close proximity of stromal mast cells and dermal dendrocytes surrounding BCC nests suggests a biologically significant interaction. The pattern observed is similar to that observed in healing wounds.     

B Cells Help Alloreactive T Cells Differentiate Into Memory T Cells

B cells are recognized as effector cells in allograft rejection that are dependent upon T cell help to produce alloantibodies causing graft injury. It is not known if B cells can also help T cells differentiate into memory cells in the alloimmune response. We found that in B‐cell‐deficient hosts, differentiation of alloreactive T cells into effectors was intact whereas their development into memory T cells was impaired. To test if B cell help for T cells was required for their continued differentiation into memory T cells, activated T cells were sorted from alloimmunized mice and transferred either with or without B cells into naïve adoptive hosts. Activated T cells cotransferred with B cells gave rise to more memory T cells than those transferred without B cells and upon recall, mediated accelerated rejection of skin allografts. Cotransfer of B cells led to increased memory T cells by enhancing activated CD4 T‐cell proliferation and activated CD8 T‐cell survival. These results indicate that B cells help alloreactive T‐cell differentiation, proliferation and survival to generate optimal numbers of functional memory T cells.     

猪肾小球内皮细胞与系膜细胞的发育过程及相互关系

目的:明确中国实验用小型猪肾小球内皮细胞与系膜细胞的发育过程及相互关系。方法:采集不同时间点(胚胎28～112d及出生后1d、7d、14d、21d)中国实验用小型猪肾组织,应用免疫荧光技术检测胚肾发育不同阶段(帽状间充质、肾小囊体、逗号形体、"S"形体、毛细血管袢期肾小球及成熟肾小球)内皮细胞标志物CD31与系膜细胞标志物α-SMA的表达情况。结果:内皮细胞标志物CD31在胚肾早期呈散在性分布,继而围绕肾小囊体和逗号形体呈"环抱"状分布,然后进入"S"形体下端的血管裂隙内聚集形成无管腔的"前毛细血管束",最后表达于成熟肾小球毛细血管内皮细胞。系膜细胞标志物α-SMA在早期胚肾、肾小囊体和逗号形体阶段均无表达;"S"形体早期分布于"S"形体周围,后期进入"S"形体下端的血管裂隙;毛细血管袢期聚集在肾小球血管极根部;随着肾小球发育逐渐向肾小球内延伸,最终表达于成熟肾小球系膜区。CD31与α-SMA双重染色的结果显示,在毛细血管袢期CD31阳性的内皮细胞聚集形成无管腔的前毛细血管束,而α-SMA阳性的系膜细胞聚集在肾小球血管极的根部;随着肾小球发育,α-SMA阳性的系膜细胞逐渐由血管极根部向肾小球内迁移,同时CD31阳性的内皮细胞逐渐形成带有管腔的毛细血管丛。结论:中国实验用小型猪肾小球内皮细胞的发育开始于后肾间充质阶段,系膜细胞的发育开始于"S"形体阶段,即肾小球系膜细胞发育在内皮细胞之后;在肾小球血管丛形成过程中,内皮细胞与系膜细胞间可能存在重要的相互作用。     

Hedgehog Signaling Between Cancer Cells and Hepatic Stellate Cells in Promoting Cholangiocarcinoma

Background

Aberrant Hedgehog (HH) signaling activation is important in cancer growth and mediates the interaction between cancer cells and the surrounding stromal cells. This study investigated the role of HH signaling on the growth of cholangiocarcinoma (CC), focusing on the interaction of CC cells with stromal cells.

Methods

To evaluate the interaction between human CC cells (SNU-1196, SNU-246, SNU-308, SNU-1079, and HuCCT-1) and stromal cells (hepatic stellate cell line, Lx-2), co-culture proliferation, migration, and invasion assays were performed. In vivo nude mice experiments were conducted using two groups—HuCCT-1 single implant xenograft (SX) and co-implant xenograft (CX) with HuCCT-1 and Lx-2.

Results

When HuCCT-1 cells were co-cultured with Lx-2 cells, the expression of HH signaling-related proteins increased in both HuCCT-1 and Lx-2 cells. Co-culture with Lx-2 cells stimulated the proliferation, migration, and invasion of CC cells, and these effects were mediated by HH signaling. Co-culture of HuCCT-1 and Lx-2 cells increased the secretion of several cytokines. In an ectopic xenograft model, Lx-2 co-implantation increased CC tumor growth and stimulated angiogenesis. Cyclopamine attenuated tumor growth in the CX group, but not in the HuCCT-1 mono-implant (SX) group. Cyclopamine treatment decreased CC cell proliferation, suppressed microvessel density, and increased tumor necrosis in the CX group, but not in the SX group.

Conclusion

Hepatic stellate cells stimulate the proliferation, migration, and invasion of CC cells, promote angiogenesis through HH signaling activation, and render CC more susceptible to necrosis by HH inhibitor.