小干扰RNA抑制肝癌HepG2细胞VEGF表达的研究

目的 观察小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)对肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制作用.方法 将VEGF siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体转染肝癌HepG2细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测VEGF mRNA和蛋白的表达,ELISA检测细胞培养上清液中VEGF蛋白浓度. 结果细胞培养6 h后siRNA的转染效率为(90.4±2.9)%,转染后肝癌HepG2细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达明显减少,细胞培养上清液中VEGF蛋白表达下降. 结论运用RNA干扰技术,可以有效地干扰肝癌HepG2细胞VEGF的表达并能降低VEGF的生成.     

PRS-CTGF-siRNA对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞细胞外基质及VEGF表达的影响

目的 观察pRetro-Super(PRS)反转录病毒载体介导的表达人结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC) 细胞外基质和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。 方法 根据siRNA靶序列要求及PRS反转录病毒载体特点分别设计4 对寡核苷酸，构建表达人CTGF基因siRNA 的PRS-CTGF-siRNA1～4重组反转录病毒载体。以脂质体2000将重组反转录病毒载体转染PT67包装细胞，继而感染HPMC。采用RT-PCR法检测mRNA表达及Western印迹法检测蛋白质表达。 结果 5 μg/L外源性转化生长因子β1（TGF-β1）刺激可诱导HPMC表达CTGF、纤连蛋白（FN）、I型胶原（Col I）、层粘连蛋白（LN）和VEGF明显增高； 而PRS-CTGF-siRNA 1～4组与TGF-β1刺激组比较，HPMC细胞内CTGF、FN、Col I、LN mRNA和蛋白表达和VEGF mRNA表达明显较低（P < 0.01），各干扰组对CTGF mRNA抑制率分别为 69.3％、22.2%、27.4%和38.8%，其中以PRS-CTGF-siRNA 1组最为明显；同时PRS-CTGF-siRNA 1组相对于TGF-β1刺激组，VEGF蛋白表达也明显较低（P < 0.01）；而PRS空载体组与TGF-β1刺激组比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 结论 PRS-CTGF-siRNA重组反转录病毒载体可明显抑制TGF-β1诱导的细胞外基质及VEGF表达的增加。     

RNA干扰沉默血管内皮生长因子对人膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响

目的 观察RNA干扰沉默血管内皮生长因子(VEGF)对膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响.方法 构建了4个针对VEGF的小干扰RNA(siRNA)表达质粒pGC-siVEGF1-4,脂质体法稳定转染T24细胞.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(EUSA)检测转染细胞VEGF mRNA和蛋白表达,噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况.结果 4个VEGF siRNA表达质粒均能明显抑制转染细胞的VEGF mRNA和蛋白表达,使细胞增殖减慢,其中以pGC-siVEGF3最为明显,细胞增殖受抑达38.9%(t=18.49,P《0.01).且该组出现了最大程度G0/G1细胞阻滞(59.8±1.4),明显大于空质粒组(48.5 ±1.5),差异有统计学意义(P《0.01),该组的细胞凋亡率也最高(17.4%).结论 VEGF siRNA表达质粒可下调T24细胞VEGF表达,抑制膀胱癌细胞生长并促进其凋亡.     

siRNA真核表达载体的构建及其对CXCR4基因的沉默效应

目的：构建趋化因子受体（CXCR4） 特异性siRNA ( small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对CXCR4基因的沉默作用。方法：采用基因克隆技术, 将合成的特异性CXCR4 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER, 构建CXCR4 siRNA真核表达载体。以脂质体法将pSUPER空载体和2个(pSUPER/CXCR4 siRNA0和pSUPER/ CXCR4 siRNA1 )重组质粒分别导入具有高转移特性的MDA MB 231乳腺癌细胞系，检测各组乳腺癌细胞内CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况。 结果：成功构建CXCR4 siRNA真核表达载体. 转染CXCR4 RNA干扰片段的乳腺癌细胞, 72 h后CXCR4 mRNA及蛋白表达下调,抑制作用明显。 结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显下调CXCR4 mRNA及蛋白的表达,为应用于乳腺癌的治疗研究提供了一定的实验基础。     

VEGF特异2'-O-甲基化修饰siRNA抑制膀胱癌VEGF表达的实验研究

目的 研究VEGF特异性化学修饰RNA干扰对膀胱癌细胞增殖的影响.方法 针对VEGF构建siRNA表达载体PsilencerTM-VEGF-siRNA,为增加siRNA的稳定性,对VEGFsiRNA进行2'-O-甲基化化学修饰.通过Lipofectamine 2000将质粒转染到膀胱癌细胞,荧光显微镜观察siRNA转染效率,确定最佳时间点;分别采用Western Blot、RT-PCR检测VEGF蛋白含量及mRNA水平变化;MTT法检测细胞增殖率.结果 ①2'-O-甲基化化学修饰PsilencerTM-VEGF-siRNA表达载体构建成功;②脂质体与DNA最佳转染效率比例为:2μl∶1μg,48 h细胞存活状态最好;③48h转染效率在50％ ～ 60％,与对照组相比,转染PsilencerTM-VEGF-siRNA后蛋白及mRNA水平均下降;④MTT法检测显示:siRNA阳性对照组、VEGFsiRNA组与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 化学修饰的siRNA能够有效抑制膀胱癌中VEGF的表达,其稳定性增加,从而有效抑制膀胱癌细胞的生长.     

碱性成纤维细胞生长因子小干扰RNA对胰腺癌细胞血管内皮细胞生长因子表达的调节作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)小干扰RNA(siRNA)对胰腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的影响.方法 利用siRNA技术抑制VEGF及bFGF表达,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰腺癌细胞株VEGF表达变化.结果 Panc-1及PCT-3细胞VEGF mRNA表达受到显著抑制,Panc-1为0.20 ±0.05,PCT-3为0.23±0.02.sw1990及PCT-3分泌VEGF受到显著抑制,sw1990为(1940.67 ±93.84) ng/L,对照组为(2560.67±181.79) ng/L;PCT-3为(174.00±98.73) ng/L,对照组为(779.33 ±317.52) ng/L.结论 bFGFsiRNA能够抑制胰腺癌细胞VEGF核酸及蛋白水平表达.     

腺病毒介导RNA干扰对人结肠癌裸鼠移植瘤淋巴管生成的抑制作用

RNA干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略[1].我们构建通过血管内皮生长因子(VEGF)-C靶向的小干扰RNA(siRNA),插入腺病毒载体,干预人结肠癌裸鼠移植瘤模型,探讨其对肿瘤生长及淋巴管生成的影响.     

小干扰RNA沉默血管内皮生长因子对ACHN肾癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)沉默血管内皮生长因子(VEGF)对ACHN肾细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 化学合成针对VEGF的小干扰RNA,实验分4组,转染后收集细胞,通过蛋白印迹方法检测VEGF的表达,噻唑蓝(MTT)比色法、细胞黏附实验、划痕实验及Transwell法测定细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.结果 siRNA 1～2组VEGF表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组;在24、48、72 h,siRNA 1～2的增殖抑制率均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05),其中以siRNA2组最为显著;与空白对照组比较,siRNA 1～2组的细胞黏附数量明显下降[(81.5±3.1)％比(40.5±2.6)％、P＜0.05,(81.5±3.1)％比(22.5±2.4)％、P＜0.05],其中以siRNA2组最为明显;siRNA1～2组的细胞迁移数量明显下降(162±9比81±5,P＜0.05;162±9比38±4,P＜0.05);siRNA1～2组细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05),且siRNA 2组的细胞侵袭能力明显低于siRNA 1组(P＜0.05).结论 VEGF基因在肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭中发挥着重要作用;以靶向VEGF的siRNA转染肾细胞癌细胞,可抑制肾细胞癌细胞黏附、迁移和侵袭能力.     

RNAi抑制前列腺癌雄激素受体表达的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)效应抑制雄激素受体(AR)的表达,观察RNAi在人前列腺癌PC3细胞中的干扰效应,寻找高效率的干扰片断。方法:设计5个针对AR的不同的siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和siRNA5)为实验组,构建表达载体并瞬时转染PC3细胞,提取总RNA和总蛋白,分别行荧光定量PCR和Western印迹检测AR mRNA和蛋白的表达,另设一无意义RNA表达载体为阴性对照组,比较实验组与对照组间的差异。结果:各实验组的AR mRNA的表达较对照组均不同程度下降,统计学分析差异有显著性(P(0.05),以siRNA1、siRNA4和siRNA5抑制效率最高,对比其余实验组差异有显著性(P(0.05),AR蛋白检测显示相同结果。结论:RNAi技术可有效地抑制前列腺癌细胞AR的表达,找到了具有较高抑制效率的siRNA并合成了其表达载体,为下一步的体内实验和药物研制奠定了基础。     

RhoC-siRNA 对裸鼠结肠癌移植瘤的生长抑制作用

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)载体介导抑制RhoC表达对人结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将人结肠癌细胞HT-29接种于裸鼠背部皮下,成功建立裸鼠移植瘤模型;成瘤后将RhoC-siRNA注射入裸鼠移植瘤瘤体,观察RhoC-siRNA对裸鼠移植瘤生长的影响,Western blot检测瘤体中RhoC、基质金属蛋白(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达.结果 RhoC-siRNA对结肠癌裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,瘤体体积重量明显减轻; RhoC-siRNA治疗后瘤体内VEGF和MMP-2蛋白表达明显下降.结论 通过抑制裸鼠结肠癌移植瘤中RhoC的表达,可以抑制肿瘤的生长并下调VEGF和MMP-2的表达水平.     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。