mTOR抑制剂一雷帕霉素对T细胞功能调控的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）作为信号通路的调节分子参与多条重要的信号转导通．路,能形成细胞对多种刺激的应答,mTOR至少存在两种功能性多蛋白复合物形式：mTORCl和mTORC2,其可发挥不同的生物学作用。雷帕霉素作为mTOR的特异性抑制剂可阻断mTOR信号通路信息的传导,调节T细胞的分化、发育、失能以及调节性T细胞（Treg）的增殖和功能,影响生长因子和细胞因子等生物活性物质的分泌,表现出有效的免疫抑制作用。     

雷帕霉素对人CD4~+CD25~+调节性T细胞体外扩增的影响

探讨有效的体外扩增人CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)的方法以及雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对人CD4~+CD25~+Treg细胞体外扩增的影响。采用免疫磁珠分离人外周血的CD4~+CD25~+Treg,并将实验分为3组:第1组在CD4~+CD25~+Treg培养体系中加入200 U/ml IL-2和包被CD3/CD28单克隆抗体的磁珠;第2组培养体系中除加入100 nmol/LRAPA以外,其余与第1组相同;第3组是CD4~+CD25~+Treg培养第12天后,将细胞进一步分选获取CD4~+CD25~+CD127~- Treg再继续培养,培养体系与第2组相同。实验结果显示,加RAPA培养的CD4~+CD25~+Treg细胞扩增效率比不加RAPA的低,但细胞的纯度明显提高(92%vs 65%)。而加RAPA培养的第2、3组CD4~+CD25~+Treg细胞在纯度上没有明显的差异。加RAPA培养的CD4~+CD25~+Treg细胞扩增后保持其无能状态。体外抑制实验显示体外扩增的CD4~+CD25~+Treg细胞对CD4~+效应T细胞增殖均有明显的抑制作用,而且加RAPA扩增的Treg细胞表现出更强的抑制功能。另外,与第1组体外扩增的Treg细胞相比,加RAPA扩增的Treg细胞表达低水平的IL-2和IFN-γ。实验证明雷帕霉素抑制了CD4~+ CD25~+Treg细胞中混杂的CD4~+效应T细胞的扩增,使用雷帕霉素可以提高体外扩增CD4~+CD25~+Treg细胞的纯度及其免疫抑制功能。     

雷帕霉素对实验性自身溶血性贫血小鼠抗自身红细胞抗体产生的抑制作用

作者介绍了一种自身免疫病的实验模型,并研究了抗真菌抗生素雷帕霉素（rapamycin;RPM）对实验性自身溶血性贫血小鼠产生抗自身红细胞抗体的预防和治疗作用、结果表明,口服2.5～10mg/kg的RPM可有效预防小鼠实验性抗自身红细胞抗体滴度的升高,并维持在1:32左右,且停药后不存在反跳现象。同时RPM也能在一定程度上抑制抗大鼠红细胞抗体的产生。此外RPM还表现了很好的治疗作用,它能使已升高的抗自身红细胞抗体滴度显著降低。与环孢菌素相比.雷帕霉素具有更强的抑制抗自身红细胞抗体产生的作用。     

雷帕霉素对同种移植耐受模型CD4+CD25+ T细胞活性的影响

目的：研究雷帕霉素（Rapa）对同种移植耐受个体CD4^＋CD25^＋ T细胞体内负免疫调节作用的影响.方法：建立同种皮肤移植模型, 受体鼠术前预输注供体鼠脾细胞, 术后给予环孢素A（CsA）进行耐受诱导.移植后第14天提取耐受诱导模型鼠的T细胞, 经不同浓度Rapa和/或IL-2体外处理后, 混合淋巴细胞反应（MLR）确定T细胞特异增殖水平;流式细胞术（FCM）检测CD4^＋CD25^＋ T细胞比例变化;RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况;ELISA检测细胞培养不同时间后上清中IL-10的变化.然后将Rapa和/或IL-2处理的T细胞过继转移给同种移植后的BALB/c-SCID鼠, 观察移植物存活状态.结果：CsA加供体脾细胞预先注射可明显延长小鼠移植皮片的存活期（P＜0.05）;移植耐受状态的T细胞经Rapa和/或IL-2体外处理后CD4^＋CD25^＋ T细胞比例升高、增殖水平明显降低、 Foxp3表达量明显增加;过继转输给同种移植SCID鼠后, 其移植皮片存活时间显著延长（P＜0.05）.结论：Rapa可体外扩增耐受诱导模型中CD4^＋CD25^＋ T细胞, 使CD4^＋CD25^＋ T细胞相关的Foxp3和IL-10明显升高, 过继免疫后, 小鼠同种移植物存活时间明显延长, 而低浓度IL-2可以协同Rapa的这一作用.     

雷帕霉素对小鼠星形胶质细胞体外诱导凋亡的影响

目的:探讨雷帕霉素(rapamycin,Rapa)对小鼠星形胶质细胞体外凋亡的影响。方法:无菌分离并体外培养C57BL/6J幼鼠脑组织星形胶质细胞。通过MTT比色法测定并分析Rapa浓度对幼鼠星形胶质细胞存活的影响;SYTOXGreen荧光染色联合荧光酶标仪检测并分析Rapa对H2O2、ionomycin、deferorxamine等诱导剂作用一定时间内细胞存活的影响;Di OC6(3)染色分析Rapa在H2O2氧化应激损伤条件下对星形胶质细胞线粒体膜电势的影响;分别采用H2DCFDA和Mito SOXTMRed荧光染色联合流式细胞术检测Rapa预适应对星形胶质细胞ROS生成以及线粒体内ROS含量的影响。结果:Rapa能促进H2O2以及ionomycin联合deferorxamine损伤作用下的星形胶质细胞的存活,对线粒体膜电势有保护作用,可降低H2O2损伤作用下星形胶质细胞ROS的产生并可以维持胞内线粒体ROS的含量在较低水平。结论:Rapa能够减少细胞内ROS的生成量并降低胞内线粒体内ROS水平;能够减轻H2O2对细胞线粒体膜的损伤破坏,维护线粒体膜电势的稳定性,进而对氧化应激损伤介导细胞凋亡有一定的抑制作用。     

mTOR抑制剂-雷帕霉素对树突状细胞功能调控的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）作为信号通路的调节器能形成细胞对各种刺激的应答,而雷帕霉素则是通过阻断mTOR参与的信号转导阻止DC的功能从而发挥其免疫抑制作用.免疫细胞能通过表面受体直接或间接地向mTOR传导信号,调节免疫应答.研究表明：mTOR可调控不同种类的抗原提呈细胞（APC）,如树突状细胞（DC）的分化与成熟、存活、迁移、抗原摄取与应答以及细胞因子产生等,对固有免疫和适应性免疫都有重要的调节作用.     

雷帕霉素对内毒素性肝损伤小鼠肝组织Bcl-2表达的影响

目的探讨雷帕霉素对内毒素性肝损伤小鼠肝组织Bcl-2表达的影响。方法健康雄性昆明小鼠36只,随机分为正常组(12)、模型组(12)和雷帕霉素组(12)。应用脂多糖10mg/kg腹腔注射小鼠诱导内毒素肝损伤模型。造模后6h取血,检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性,免疫组织化学方法和Western blot方法检测各组小鼠肝组织Bcl-2的表达。结果模型组血清ALT、AST含量明显高于正常组(P0.01);雷帕霉素组血清ALT、AST含量明显降于模型组(P0.05)。与正常组相比,模型组小鼠肝组织Bcl-2表达显著降低(P0.01);而与模型组相比,雷帕霉素组小鼠肝组织Bcl-2表达显著升高高于(P0.01)。结论雷帕霉素能够上调内毒素性肝损伤小鼠肝组织Bcl-2的表达。     

雷帕霉素抗神经退行性病研究进展

雷帕霉素作为一种传统的抗真菌药物，具有免疫抑制剂和抗肿瘤的作用。值得注意的是，它通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白mTOR、受体FKBP、VMP1，促进自噬，抑制了帕金森病、亨廷顿病等神经退行性变的病理过程，从而有望成为一种新的抗神经退行病药物。本文对其新的研究进展予以综述。     

T细胞疫苗的实验设想、证实及应用

把引起自身免疫性疾病的自身反应性T细胞或导致同种移植排斥反应的同种反应性T细胞看作是致病性T细胞,将它们活化并灭活后,以疫苗的形式免疫动物,诱导机体产生针对致病性T细胞或同种反应性T细胞的免疫应答,从而消除或减轻这些细胞的致病作用;表现为对自身免疫性疾病和对同种移植物排斥的防治作用。这一方法称为T细胞疫苗接种（TCV）。TCV的作用机制是上调免疫网络中的抑制性作用,产生了抗独特型T细胞,抑制了相应克隆T细胞的作用。用TCR多肽免疫替代TCV亦是有效的方法。TCV或TCR多肽免疫对防治自身免疫性疾病有潜在的应用价值,对控制同种排斥反应也是一条有效措施。     

自身免疫病患者T淋巴细胞表型分析

本文报告利用流式细胞仪检测了１０例系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者、１８例干燥综合症（ＳＳ）患者、３７例风湿性关节炎（ＲＡ）患者和１６例人外周血Ｔ淋巴细胞表型，发现ＳＬＥ患者ＣＤ３＾＋Ｔ细胞明显降低，ＳＳ和ＲＡ患者正常；ＳＬＥ患者ＣＤ４＾＋／ＣＤ８＾＋Ｔ细胞比值倒置，ＳＳ和ＲＡ正常，但ＳＳ和ＲＡ ＣＤ８＾＋Ｔ细胞明显减少。文中对这三种疾病发病机理进行了初步讨论。     

HIV早期和慢性感染者不同亚群T细胞BTLA的表达

目的:对中国HIV早期和慢性感染者不同亚群T细胞BTLA表达水平及与疾病进展相关性进行研究,探讨BTLA表达在HIV感染中的作用。方法:选取21例HIV早期感染者、29例HIV慢性感染者及23例正常对照,应用流式细胞仪检测CD4+CD45RA+、CD4+CD45RA-、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RA-及总CD4+、CD8+T细胞BTLA表达水平,同时分析CD4+HLA-DR+、CD4+CD38+、CD8+HLA-DR+、CD8+CD38+T细胞表达水平,分析不同亚群T细胞BTLA表达水平与疾病进展及免疫活化的相关性。结果:HIV早期感染组各亚群T细胞BTLA表达水平高于正常对照,其中CD4+CD45RA-、CD8+CD45RA-、总CD4+T细胞BTLA表达水平在两组之间差异具有统计学意义(P<0.01);HIV早期感染组各亚群T细胞BTLA表达水平高于慢性感染者,除CD8+CD45RA-T细胞外,其它亚群T细胞BTLA表达水平在两组之间差异具有统计学意义(P<0.01);慢性HIV感染者CD8+CD45RA+T细胞BTLA表达水平低于正常对照,差异显著(P<0.01),其余T细胞亚群BTLA表达水平在两组之间无明显差异。HIV感染者T细胞亚群BTLA表达水平与T细胞活化水平负相关:除CD8+CD45RA-T细胞外,各亚群T细胞BTLA表达百分率与T细胞活化(CD4+HLA-DR+T细胞表达)水平明显负相关(P<0.01);各亚群T细胞BTLA表达水平与CD4+CD38+、CD8+CD38+T细胞表达水平无明显相关性。HIV感染者总CD8+T细胞BTLA表达水平与CD4+T细胞数量明显正相关(P<0.01)。结论:中国HIV感染者T细胞BTLA表达与疾病进展及免疫活化状况显著相关,早期感染阶段BTLA表达升高,慢性感染期表达下降,为明确HIV的致病机制及免疫治疗提供线索。     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

BTLA信号对T细胞活化的起始和早期阶段的调节作用

目的:观察BTLA分子在T细胞上的表达并探讨其在各个阶段不同时相对T细胞活化的抑制。方法:分离人外周血单个核细胞,经阴性选择磁珠分离纯化获得T淋巴细胞。检测T细胞上BTLA、CTLA-4和PD-1的表达;用CD3抗体刺激T细胞活化,比较BTLA、CTLA-4和PD-1在T细胞活化过程中的动态表达。CD3抗体联合CD28抗体活化T细胞,在不同的活化时间,MTT法检测BTLA单抗8H9对T细胞增殖的影响。GM-CSF和IL-4体外诱导单核细胞分化成未成熟DC,CD40抗体刺激DC成熟,流式检测HVEM在DC上的表达。用DC诱导T细胞活化,加入游离8H9或抗HVEM抗体,阻断HVEM和BTLA结合,MTT法检测T细胞增殖。结果:静止T细胞组成性高表达BTLA,不表达CTLA-4和PD-1分子。T细胞活化后,BTLA分子表达有所降低,然后迅速回升至高水平。CTLA-4、PD-1分子在活化后两天几乎不表达,第三天开始表达并逐渐上升。8H9可以抑制CD3和CD28抗体活化的T细胞增殖。CD3和CD28抗体预先活化T细胞24小时或48小时后,再加入8H9仍然具有抑制效应,但不如在T细胞活化之初加入8H9的抑制效应。单核细胞诱导的不成熟DC上高表达HVEM,当DC成熟后,HVEM表达降低。用游离8H9或HVEM抗体阻断DC表面HVEM与T细胞表面BTLA结合,48小时之内均明显增强了DC诱导的T细胞增殖。结论:BTLA信号可以提高T细胞的活化阈值,在T细胞活化的起始和早期阶段发挥重要的负性调控作用。     

人外周血T淋巴细胞胀亡现象的观察

目的观察人外周血T淋巴细胞的胀亡现象,探讨建立T细胞胀亡检测方法.方法密度梯度离心法及尼龙棉柱法分离健康成年人外周血T淋巴细胞,分空白组及地塞米松组,培养后观察细胞光镜、荧光镜及电镜形态学,并用流式细胞仪检测胀亡细胞比例变化.结果①人外周血T淋巴细胞经96小时体外培养,可自然出现典型细胞胀亡形态学改变.②经72小时培养,不同浓度地塞米松组(1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3 mol/L)T细胞的胀亡率分别为(3.49±0.42)%、(5.17±0.48)%、(8.44±0.72)%、17.93±1.50)%.③在1×10-5mol/L地塞米松作用下,不同培养时间(48、72、96、120小时)T淋巴细胞的胀亡率分别为(0.53±0.10)%、(6.36±0.80)%、(20.60±1.59)%、25.56±1.76)%.结论人外周血T淋巴细胞存在胀亡现象,地塞米松可诱导人外周血T淋巴细胞胀亡.     

BTLA/HVEM抑制信号通路研究进展

BTLA是新近发现的Ig家族的抑制性受体,其唯一配体HVEM,来自TNF受体超家族,可与TNF家族的LIGHT结合提供正向刺激信号.而BTLA与HVEM的相互作用传递抑制信号下调淋巴细胞的免疫应答.这两个来自不同家族的受体间的负向调节作用,改变了对传统抑制性信号通路作用方式的看法.通过介绍目前对其生物学特性、信号传导机制及与相关疾病关系的研究,为进一步深入了解免疫应答的调控机制及寻找治疗自身免疫病、移植排斥、肿瘤等疾病的新方法提供参考.     

小鼠BTLA胞外功能区基因克隆表达及其对DC表面B7分子表达的影响

目的:研究重组谷胱甘肽S-转移酶(GST)-小鼠B/T细胞弱化因子包外功能区(mBTLAext)融合蛋白(GST-mBT-LAext)对小鼠树突状细胞系DC2.4表面B7分子表达的影响。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB-TLAcDNA。将其胞外功能区基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2/mBTLAext并转化E.coliBL21(DE3),以1mmol/L的IPTG诱导表达。提取包涵体,经变性、负性后,采用GlutathioneSepharose4B柱纯化可溶性的GST-mBTLAext。将不同浓度的GST-mBTLAext加入到DC2.4的培养体系中,采用流式细胞术检测其对DC上B7-1和B7-2表达的影响。结果:成功地克隆了mBTLA基因,并构建了重组原核表达载体。变性、复性,经GlutathioneSepharose4B柱纯化,获得了可溶性的GST-mBTLAext融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定表明,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为43000,同预期的结果一致。流式细胞术检测显示,GST-mBTLAext可上调DC2.4上B7-1的表达并呈剂量依赖性,这一作用可被抗GST-mBTLAext血清阻断。未检测到GST-mBT-LAextDC2.4上B7-2的表达有影响。结论:BTLA对DC2.4表面B7分子表达的上调可能是BTLA-HVEM途径反向信号对DC作用的结果,对进一步研究其对DC生物学行为的影响及其分子机制具有重要的理论意义。     

Targeting of peripheral blood T lymphocytes

Conclusions In summary, human single-chain gene transduced T cells were shown: to express the scFv on their surface, to recognize their relevant ligand (tumor-associated antigen) on tumor target cells, to produce cytokines and, to lyze tumor cells. In our earlier review on retargeting T lymphocyte specificity [11], we concluded that a number of questions needed to be answered: (1) Is triggering of cytolysis by CTL or lymphokine production most important to generate anti-cancer effects? Both are important, especially to eliminate bystander cells which do not express tumor-associated antigen [35, 75, 83, 106]. (2) Can targeted CTL traffick and home to the tumor site? Yes, they can. (3) Does humanization of mouse mAbs reduce HAMA responses? Our preliminary experiences suggest that this is the case (unpublished data).Significant progress has therefore been made in the laboratory and in clinical tests, and will continue to be made. We are now preparing for the clinical phase I/H testing of in vivo anti-tumor activity of T lymphocytes retargeted by transfer of chimeric receptor genes encoding Ab-type specificity.     

O-Acetyl GD3 ganglioside in human peripheral blood T lymphocytes

O-acetyl GD3 ganglioside is a cell surface molecule of someneural, neural crest and renal cells. Here we show, by usingmAbs specific for O-acetyl GD3 (clone 27A) and flow-cytomotric,biochemical or immunological techniques, that it is also expressedat high intensity level on the surface of 49.6% (median) ofthe CD3⁺ cells (T lymphocytes), at medium level in 16.2% ofthe CD16⁺ (natural killer) cells, at very low level in 51.9%of CD14⁺ cells (monocytes) and in 6.9% of CD20⁺ cells (B lymphocytes),but not in other human blood cells. Of the CD4⁺or CD8^* cells,52.6 or 36.5% respectively were 27A⁺. Furthermore, 81.6% ofthe CD45RO⁺ lymphocytes carried the O-acetyl GD3 ganglloslde.It was not detected in the thymus, although its immediate precursor,the GD3 ganglioside, was present in the meduilary thymocytes,suggesting that O-acetyltransferases are regulated by maturationevents taking place in the periphery. The anti-O-acetyl GD3antibodies induced a strong mitogenic response in cultured peripheralblood mononuclear cells, but not in purified T cells. However,in combination with phorbol myristate acetate the antibodiesinduced proliferation also in purified T cells, suggesting thatprotein kinase C priming is needed for this effect. This andthe restricted expression of O-acetyl GD3 suggest a functionalrole for this ganglioside in T cell subpopulations.     

The influence of cyclosporin A on lymphocyte attenuator expression

B and T lymphocyte attenuator (BTLA), a recently identified immune inhibitory receptor, has been demonstrated to have the ability to maintain self-tolerance and transplant-tolerance in mice. However, little is known about the effects of immunosuppressive drugs on the expression of BTLA. In the present study, we observed that the immunosuppressive drug cyclosporin A (CsA) could significantly reduce BTLA but not CD25 and CD69 expression on CD4+ T cells during activation in vitro, while rapamycin (RPM) had little effect on it. Exogenous interleukin-2 (IL-2) failed to reverse the inhibitory effect that CsA had on BTLA expression. Furthermore, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) or ionomycin alone could efficiently induce BTLA protein expression on CD4+ and CD8+ T cells, while CsA significantly suppressed BTLA expression in this system. The present data indicate that the regulation of BTLA expression on CD4+ T cells does not depend on IL-2 and T cell activation but depends on calcineurin-dependent and calcineurin-independent pathways. The observation that CsA significantly inhibits BTLA expression on CD4+ T cells during activation, suggests that CsA might block the immune tolerance induced by BTLA and potentially increase the susceptibility to autoimmune diseases and graft rejection.     

人外周血T淋巴细胞表型改变与衰老相关性研究

目的：探讨人T淋巴细胞表型随年龄变化的规律，寻找敏感的免疫衰老生物标志。方法：取年轻组(20—35岁)和年老组(50—75岁)志愿者的新鲜肝素抗凝静脉血，进行三色或四色直接免疫荧光染色，获取有核细胞后以流式细胞仪分析T细胞亚群的表型。结果：2个年龄组的总T细胞(CD3^ )、辅助T细胞(CD4^ )以及细胞毒T细胞(CD8^ )亚群的相对百分率没有明显差别，但年老组T细胞上CD3分子的密度(MFI)明显下降；粘附分子CD44与CD62L在3群T细胞上阳性率的差别均无统计意义；而2组间总T细胞、辅助T细胞以及细胞毒T细胞亚群的CD95阳性率都有显著差别，表现为随年龄增加，CD95表达率上升。结论：在所研究的年龄组间，T细胞及其亚群的相对数量没有显著改变，而CD3表达密度随年龄增加而下调；T细胞的凋亡诱导分子CD95阳性率随年龄增加而上升，提示CD95可能是评价免疫衰老的潜在生物标志。