口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

目的:制备抗硫氧还蛋白-1(TRX-1)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:以原核表达的TRX-1为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合.采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析,用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定.结果:得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株B6、D5和E3,免疫球蛋白亚类均为IgG>(к),腹水mAb效价均在106以上,3株抗体分别针对不同抗原表位.用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 μg/L.结论:获得3株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株,为研究TRX-1在人类细胞、血液、组织中的表达及定位提供了可能,并为探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具.     

抗IL-13Rα2单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在成功制备小鼠抗人IL-13Rα2高亲和力单克隆抗体(mAb)的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人IL-13Rα2 mAb杂交瘤细胞LX147-7中提取总RNA,以此为模板反转录获得cDNA,用针对小鼠mAb重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应。将PCR产物连入克隆载体,经筛选阳性克隆,PCR和酶切鉴定正确后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因。结论:获得了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因序列,为构建相关基因工程抗体打下了良好基础。     

体外重组表达血管生长因子VEGF165单克隆抗体的制备及鉴定

目的:研制人VEGF165单克隆抗体(mAb),为研究VEGF165的生物学活性提供基础.方法:应用RT-PCR从脐静脉内皮细胞中克隆人VEGF165基因,克隆人原核表达载体pGEX-6P1中获得重组表达载体pGEX-6P1 -VEGF165,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得重组人VEGF165蛋白,将重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,制备人VEGF165高效价的mAb.通过鸡胚血管形成抑制实验、HUVEC迁移抑制实验以及HUVEC血管形成抑制实验,对获得的人VEGF165特异性mAb进行进一步鉴定.结果:成功地从脐静脉血管内皮细胞中克隆出人VEGF165基因,并在大肠杆菌表达系统中获得高效表达,以纯化重组蛋白作为免疫原免疫小鼠,筛选获得5株分泌人VEGF165特异性mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为5A6、3F5、6H3、7D10、7A10,其中5A6、3F5、6H3、7D10分泌的mAb亚类为IgG2a,7A10分泌的mAb亚类为IgG2b,抗体轻链均为κ链.5株mAb均能抑制鸡胚血管形成、抑制HUVEC迁移和及血管形成.结论:所获得的mAb具有效价高,活性强的优点,为抗肿瘤血管研究中进一步研究VEGF165的生物学作用提供了重要的基础.     

应用噬菌体肽文库筛选mAb F3特异性结合肽

目的 应用噬菌体展示肽文库筛选可与汉坦病毒囊膜蛋白中和性单抗（mAb） F3特异性结合的配体肽。方法 以F3mAb为筛选配基，对噬菌体展示和随机12肽文加进行3轮生物亲和淘选；用夹心ELISA和竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果 通过3轮生物淘选，能被抗体捕获的噬菌体克隆为21／22，ELISA测定显示，筛选到的噬菌体短肽能与F3mAb特异性结合。序列分析表明，7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT；同源性分析显示，该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性。结论 本研究为基于表位水平的HFRSV特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要的依据。     

抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F单克隆抗体制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F(OprF)的单克隆抗体(mAb),并建立双mAb夹心ELISA检测方法。方法:利用分子生物学方法克隆OprF基因,诱导表达并纯化OprF。用OprF免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,并用ELISA法测定mAb的免疫活性;建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法,并对其敏感性、特异性进行初步评价。结果:成功地克隆OprF基因,经诱导表达获得铜绿假单胞菌的OprF。通过杂交瘤技术筛选出4株mAb:6D8F7、2H2B6、3C2F5和7B5D9,经鉴定mAb 6D8F7可作为捕获抗体,mAb 7B5D9被HRP标记后可作为检测抗体,以这2株mAb建立的双mAb夹心ELISA方法重复性好、特异性强,敏感性高达到1×103集落形成单位(CFU/mL)。检测的线性范围为1×103～108CFU/mL。与传统的细菌分离方法比较,检测临床标本的符合率高达94.7%。结论:通过杂交瘤技术制备抗铜绿假单胞菌OprF的mAb,并建立了高特异性、高敏感性检测铜绿假单胞菌抗原的双mAb夹心ELISA方法,可用于临床检测铜绿假单胞菌的感染。     

CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定

目的:对通过CDR3导向抗体库法筛选到的3株人源化膀胱癌噬菌体抗体进行进一步分析鉴定.方法:用ELISA方法对筛选特异性克隆进行特异性鉴定、抗原表位的核实;采用硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力;选用活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验.结果:3株阳性克隆可溶性表达后能够与膀胱癌EJ细胞特异性结合;与鼠源噬菌体抗体(BDI)相比,2株克隆的亲和指数比较低,均为0.25 mol/L,1株克隆的亲和指数为0.7 mol/L,略低于鼠源的亲和指数(0.9 mol/L)的水平.选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验,显示该克隆能够与癌组织特异性结合.结论:用CDR3导向库法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠源单克隆抗体(mAb)BDI的特性.     

EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定

目的:筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb), 并对其特异性和抗原表位进行鉴定.方法:采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb, 并进行抗体的中和效价、交叉反应性以及表位进行分析.结果:筛选出1株抗EV71病毒的mAb, 纯度大于95%, 抗体滴度达到10-7, 对EV71病毒具有广谱中和特性, 与CA16无交叉反应, 为VP1特异性, 并识别EV71的构象型表位.结论:筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病毒的mAb, 为研制EV71病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具, 并为研制治疗性mAb提供了条件.     

人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

应用于胶体金免疫层析的MDMA单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备高特异性的抗3,4亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）单克隆抗体,用于建立快速检测MDMA的胶体金免疫层析方法。方法：用MDMA人工抗原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经亚克隆筛选得到稳定分泌抗MDMA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备腹水,辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到抗MDMA单克隆抗体（mAb）,并用胶体金免疫层析筛选出适用的抗MDMA单克隆抗体（mAb）,并对其进行特异性、纯度、亚类的鉴定分析。结果：经多次亚克隆后筛选得到4C10、4D10、7D11、8D4 4株分泌抗MDMA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中细胞株8D4分泌的抗体适用于胶体金免疫层析。结论：成功筛选出能稳定分泌mAb的细胞株,为MDMA快速检测试剂的研制提供了关键材料。     

抗人HPPCn单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高灵敏度的抗人HPPCn单克隆抗体(mAb),以用于HPPCn的功能研究及其疾病相关性研究。方法:用重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆,获得稳定分泌抗人HPPCn mAb的细胞株。采用间接ELISA、Western blot、Ig亚类快速定性试纸分析法等鉴定抗体的生物学特性;通过细胞免疫荧光实验观察了HPPCn蛋白的细胞定位。通过噬菌体肽库技术分析抗体所识别的抗原表位。结果:得到了1株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,命名为W2-D5。经Ig亚类分析确定,该细胞株分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA检测表明,该抗体检测HPPCn的极限为0.1μg/L;Western blot结果显示,该抗体能特异性识别HPPCn。细胞免疫荧光实验,证实了HPPCn蛋白定位在细胞核。通过肽库筛选及表位分析认为,该抗体识别的表位可能为HPPCn7-13(IHLELRN)。结论:成功地获得了抗人HPPCn的特异性mAb。     

轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达及单克隆抗体的制备

目的:制备人B组轮状病毒WH-2株vp7基因的单克隆抗体(mAb),并研究其免疫学特性。方法:将B组轮状病毒WH-2株vp7基因克隆至pGEX-KG载体,然后转入大肠杆菌E.coliTop10,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化蛋白GST-VP7并免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化,获得稳定分泌mAb检测为阳性的细胞株。结果:经过3次克隆化筛选,最终得到1株能和GST-VP7蛋白反应稳定分泌mAb的阳性细胞克隆,这些mAb通过Western blot鉴定结果显示其具有良好的特异性。结论:人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达及mAb的制备体能用于GBRV结构和功能的研究,也为其引起的疾病预防、诊断和治疗等研究和临床诊断奠定了基础。     

生物传感器对抗戊型肝炎病毒单克隆抗体部分特性的研究

目的　应用生物传感器对新制备的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体 (mAb)的亲和力、Ig亚类 (型 )及抗原结合的动力学进行研究。方法　用HEVORF2区基因工程重组蛋白NE2 ,免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备mAb ,采用ELISA、Westernblot和生物传感器鉴定其有关特性。结果获得 12株可稳定分泌抗NE2mAb的杂交瘤细胞系。用ELISA及生物传感器等鉴定各株mAb ,分别为IgM和IgG1、IgG2a,轻链均为κ型。其中在用ELISA法对mAb3F5亚类鉴定过程中 ,发现其与HRP GAMIgG2a和HRP GAMIgM均有反应 ,生物传感器鉴定其为IgM。Westernblot验证各株mAb的特异性 ,同时各株mAb对于不同聚合形式的NE2蛋白的反应性有一定的差别。应用生物传感器测定了 4株mAb的KD 值 ,mAb 8C11为 4 .36× 10 7,mAb8H3为 1.5 3× 10 5,mAb 13D8为 1.2 1× 10 6,mAb 16D7为8.0 3× 10 7。从生物传感器测得的各株mAb与NE2的结合、解离过程中发现 ,mAb 8H3与NE2可快速结合、快速解离 ,其它 3株mAb结合稳定。结论　经多种方法鉴定 ,所获得的 12株杂交瘤细胞分泌的抗体 ,为抗HEVORF2区段的特异性抗体     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链

目的:以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板,筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。方法:利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因,克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序,对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的γ-sm为抗原,对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定。最后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库。利用纯化的γ-sm3轮亲和淘筛后,5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体。ELISA进一步检测表明,5个克隆均呈特异性阳性反应,其中2个克隆亲和力较高,测序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于IGKV4-101胚系基因家族。结论:利用鼠源Fd片段为模板,导向筛选杂合噬菌体库,成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株HN单克隆抗体的研制及免疫学反应

目的:制备抗新城疫病毒(NDV)Class Ⅰ强毒分离株9a5b的单克隆抗体.方法:以9a5b尿囊液为免疫原,接种6周龄BALB/c小鼠,以血凝抑制(HI)和间接免疫荧光(IFA)检测所获得的mAb.结果:成功制备获得NDV血凝素(HN)特异性mAb 4株.免疫特性鉴定表明:在这4株mAb中,3H7和3H9株仅具有IFA和HI效价,且呈现Class Ⅰ毒株特异性.结论:该抗体材料为NDV Class Ⅰ和Ⅱ毒株的血清学鉴定提供极大的便利工具,并为NDV HN功能及受体学研究奠定了基础.     

抗人Flt-1单克隆抗体的制备和活性鉴定

目的:制备小鼠抗人血管内皮生长因子受体-1(Flt-1)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法:以重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白为抗原,通过经典的杂交瘤制备和活性筛选方法建立能稳定分泌抗Flt-1蛋白的mAb杂交瘤细胞株。结果:经传统的小鼠腹水型抗体的制备和纯化方法获得了高纯度的抗人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb。ELISA方法测定出该抗体的免疫球蛋白亚型为IgG1,轻链为κ链。West-ern blot结果显示该抗体能特异性地识别重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白,FACS结果表明该抗体能结合到Flt-1阳性的脐静脉内皮细胞和K562/A02细胞表面,并呈现出抗体浓度依赖性。结论:成功建立了1株能够稳定分泌抗重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb细胞株XA12,为今后进一步开展Flt-1及其胞外Ⅲ区蛋白的生物学功能研究以及基因工程抗体研究奠定了基础。     

抗人IgG单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价的抗人IgG单克隆抗体(mAb),并用于肾脏免疫性疾病的免疫荧光诊断。方法:以人IgG全长分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,经筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗IgGmAb的杂交瘤细胞株。用ELISA及Westernblot鉴定mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)。以纯化的mAb建立免疫荧光染色法,并用于肾小球肾炎的诊断。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人IgGmAb的细胞株,腹水效价为1×10-6,Ig亚类为IgG2a(κ),相对亲和力达到1×10-5,Westernblot显示在相对分子质量(Mr)为53×103处出现特异性的条带,说明mAb能与IgG的γ链特异性结合。免疫荧光染色的结果显示,IgG分子在肾小球肾炎的活检组织中表达。结论:获得1株能特异性识别人IgG的mAb,可用于肾脏免疫性疾病的病理诊断。     

抗人红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定

目的:制备抗人红细胞膜抗原的非凝集型单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:应用杂交瘤技术,以人O型红细胞膜抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,用聚凝胺试管法筛选识别红细胞表面共同抗原的抗体,玻片凝集实验剔除凝集型抗体(完全抗体),再将分泌非凝集型mAb(不完全抗体)的杂交瘤细胞株用有限稀释法克隆化3次。对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞2E8。mAb2E8为IgG1类,可特异性地识别红细胞膜上的H抗原,没有种属交叉血凝反应。杂交瘤细胞的培养上清与人的A、B、AB和O型红细胞均能产生强凝集,凝集效价为1∶1024,腹水mAb的凝集效价达到1∶64×106。mAb的亲和力用凝集试验检测,出现血凝的时间为7s,3min以内凝块>1mm。结论:成功地制备了针对红细胞膜H抗原的非凝集性mAb,此mAb的凝集效价、相对亲和力及特异性均较良好,为构建双特异性抗体奠定了基础。     

hPPARγ2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备鼠源抗hPPARγ2单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:利用已建立的pMD18-T/hPPARγ2亚克隆扩增出hPPARγ2前1017bpcDNA。利用pET原核表达系统表达了含有hPPARγ2前339个氨基酸(C-Histag)融合蛋白,并进行了纯化。其次利用原核表达的重组hPPARγ2蛋白制备了特异性抗hPPARγ2单克隆抗体1B4、3H2、3H10、10D6和10D8。通过ELISA和Western blot及细胞免疫化学的方法对抗体进行了特异性鉴定。结果:成功制备了鼠抗hPPARγ2单克隆抗体,并证明这5株单抗均为hPPARγ2的特异性抗体。结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高特异性的hPPARγ2抗体。这些系统的建立和鼠抗hPPARγ2单克隆抗体的制备为后续的针对hPPARγ2作用及机制研究提供了良好的工具。