周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响

背景：在力学刺激下,肌肉组织发生改建,其中的成肌过程是一个多阶段的发育过程,细胞外基质的许多信号参与了成肌过程,其中力学信号是肌肉形成和再生的重要外界因子。目前国内外有许多关于周期性张应力刺激成肌细胞凋亡和增殖的报道,但是力学刺激在成肌作用中的具体机制目前还明确。目的：探讨周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用及影响机制。方法：采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力,分别作用6,12,24 h。结果与结论：MTT结果显示,随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的增殖情况及S期的细胞周期率逐渐增加,在应力作用12 h时增殖效果最明显（P〈0.05）,随后开始降低。Western blot检测显示,C2C12成肌细胞中核转录因子κB蛋白的表达随加力时间增加而不断减少,加力24 h时表达量又开始上升。结果提示,周期性张应力可以诱导C2C12成肌细胞增殖,能够改变其细胞周期,核转录因子κB可能也参与了此调节过程。     

p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡(英文)

背景:在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、实验条件的不易控制而很难得到满意结果。目的:在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,研究p38MAPK信号通路在成肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法:将体外培养的C2C12细胞分为对照组和SB203580组,SB203580组中加入20mmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580。应用细胞应力加载装置FlecellStrainUnit-5000T给细胞提供15%的力值,分别施加0,6,12,24h的周期性张应力。每分钟10个循环,每循环包括3s牵张,3s松弛。Hoechst33258染色观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测促凋亡基因baxmRNA的表达;Westernblot检测信号通路中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达。结果与结论:随着加力时间的延长,细胞逐渐出现核固缩及凋亡小体,凋亡率增加(P<0.05),baxmRNA表达增多(P<0.05);细胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均在加力6h达到最低,此后逐渐升高。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制加力引起的细胞凋亡,减少baxmRNA及p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达(P<0.05)。说明p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中起到重要的作用。     

p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡

背景：在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、实验条件的不易控制而很难得到满意结果。目的：在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,研究p38MAPK信号通路在成肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法：将体外培养的C2C12细胞分为对照组和SB203580组,SB203580组中加入20mmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580。应用细胞应力加载装置FlecellStrainUnit-5000T给细胞提供15%的力值,分别施加0,6,12,24h的周期性张应力。每分钟10个循环,每循环包括3s牵张,3s松弛。Hoechst33258染色观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测促凋亡基因baxmRNA的表达;Westernblot检测信号通路中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达。结果与结论：随着加力时间的延长,细胞逐渐出现核固缩及凋亡小体,凋亡率增加（P〈0.05）,baxmRNA表达增多（P〈0.05）;细胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均在加力6h达到最低,此后逐渐升高。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制加力引起的细胞凋亡,减少baxmRNA及p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达（P〈0.05）。说明p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中起到重要的作用。     

对白细胞介素-1β激活核转录因子-κB介导A549细胞分泌细胞间黏附分子-1作用的研究

目的 研究白细胞介素-1β(IL-1β)对A549细胞表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的诱导作用及相关细胞内信号通路的激活和转导机制.方法 以1 μg/L终浓度的IL-1β刺激经SC-514[核转录因子-κB(NF-κB)的IKK-2复合物抑制物]预处理的A549细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测IL-1β刺激5、10、30、60 min时细胞内磷酸化NF-κB抑制蛋白(pIκBα)和IκBα蛋白表达水平;激光扫描共焦显微镜(LSCM)显像检测NF-κB p65的核转移过程;按试剂盒说明测定NF-κB DNA结合活性;p65抗体染色质免疫沉淀结合聚合酶链反应(ChIP-PCR)技术检测乙酰化组蛋白H4和p65与ICAM-1基因启动子的结合;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测4 h后的ICAM-1 mRNA表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测24 h后细胞表面的ICAM-1蛋白表达.结果 IL-1β刺激后细胞内pIκBα蛋白表达水平明显升高,IκBα蛋白表达水平明显下降;LSCM检测显示激活的p65蛋白从胞质向胞核转移,p65与DNA结合活性明显升高(P<0.01).ChIP-PCR扩增发现,IL-1β促使乙酰化组蛋白H4和p65与ICAM-1基因启动子区域的DNA片断结合.IL-1β刺激4 h后ICAM-1 mRNA表达明显升高,刺激24 h后A549细胞表面ICAM-1蛋白表达亦明显升高(P均<0.01).SC-514阻断了pIκBα蛋白的升高和IκBα蛋白的下降;减少了p65蛋白的核转移和DNA结合活性;降低了ICAM-1的mRNA及蛋白表达水平(P均<0.01).结论 IL-1β通过激活NF-κB 介导了A549细胞表达ICAM-1.     

花旗松素通过抑制NF-κB信号通路对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用

目的探讨花旗松素通过抑制核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。方法将H9c2细胞分为A组、B组、C组、D组、E组,A组于37℃、5%CO_2恒温箱中培养30 h; B组缺氧(O_2浓度6%的厌氧培养箱)培养24 h,再复氧(37℃、5%CO_2恒温箱)培养6 h; C组加入1μmol/L花旗松素,缺氧培养24 h,复氧培养6 h; D组加入10μmol/L花旗松素,缺氧培养24 h,复氧培养6 h; E组加入100μmol/L花旗松素,缺氧培养24 h,复氧培养6 h。比较各组H9c2细胞形态学变化、存活率、凋亡率、NF-κB蛋白表达量、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)蛋白表达量。结果 HE染色显示,A组细胞形态结构正常,B组H9c2细胞形态结构异常,横纹模糊,可见大量点状坏死灶,间质水肿明显,炎性细胞浸润明显; C、D、E组H9c2细胞病理改变较B组显著改善,随着花旗松素剂量增大,H9c2细胞病理改善越明显。B组H9c2细胞存活率、IκB-α蛋白表达量较A组明显下降(P 0. 05); C、D、E组H9c2细胞存活率、IκB-α蛋白表达量较B组明显升高(P 0. 05),呈剂量依赖性。B组H9c2细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达量较A组明显升高(P 0. 05); C、D、E组H9c2细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达量较B组明显下降(P 0. 05),呈剂量依赖性。结论花旗松素通过抑制NF-κB信号通路对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤起到保护作用,并这种作用呈剂量依赖性,这可为心肌缺血再灌注损伤的防治提供新的方向。     

C反应蛋白激活单核细胞核因子-кB及辛伐他汀干预

目的:观察C反应蛋白(CRP)刺激人外周血单核细胞核因子-κB(NF-κB)活化及白细胞介素-6(IL-6)表达,予辛伐他汀干预,探讨CRP/NF-κB在动脉粥样硬化(AS)致病机制中的作用和辛伐他汀的抗AS效应。方法:密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,免疫细胞化学观察CRP致单核细胞NF-κBp65活化的时间效应,ELISA法观察IL-6产生的时间-浓度效应,其峰值分别与辛伐他汀抑制剂组比较。结果:CRP刺激单核细胞NF-κB活化呈时间依赖性,高峰在2h,单核细胞表达IL-6呈时间与浓度依赖性,在24h达高峰。辛伐他汀(1×10-8mol/L～1×10-6mol/L)呈剂量依赖性抑制NF-κB活化与IL-6表达。结论:CRP激活正常人单核细胞NF-B信号途径,并诱导单核细胞产生IL-6,辛伐他汀抑制单核细胞NF-κB活性与IL-6表达,提示CRP/NF-κB信号途径在促进AS发病机制中起重要作用,辛伐他汀抑制NF-κB有可能减轻或抑制AS进展。     

从TLR4/NF-κB通路探讨芪药鸡金粥对化疗后大鼠肠道紧密连接蛋白的影响

目的:从TLR4/NF-κB信号通路的角度探讨芪药鸡金粥对化疗后大鼠肠道紧密连接蛋白的影响,进一步明确芪药鸡金粥调控化疗后肠黏膜损伤的作用机制;初步明确芪药鸡金粥不同剂量与相关指标变化间的量效关系。方法:将40只SPF级Wistar大鼠随机分为模型组、高剂量药膳组、常规剂量药膳组、低剂量药膳组和空白组,每组各8只。实验第1天对模型组及各剂量药膳组行5-FU150mg/kg一次性腹腔注射,复制化疗所致胃肠黏膜损伤大鼠模型,空白组给予等量生理盐水腹腔注射。实验结束采用ELISA法检测各组大鼠肠道TLR4/NF-κB信号通路蛋白以及大鼠肠道紧密连接蛋白的表达水平。结果:各组大鼠Claudin-1、ZO-1和JAM-1紧密连接蛋白表达水平的差异有统计学意义(P0.05);各组大鼠Occludin紧密连接蛋白表达水平差异无统计学意义;各组大鼠IκBα和TLR4通路蛋白变化水平的差异有统计学意义(P0.05);各组大鼠NF-κBp50及NF-κBp65通路蛋白表达水平差异无统计学意义。结论:芪药鸡金粥可上调化疗后大鼠胃肠道Claudin-1及JAM-1紧密连接蛋白水平,但对Occludin及ZO-1紧密连接蛋白表达的调控作用尚不明确;其对TLR4/NF-κB信号通路中的IκBα蛋白具有一定的抑制作用,但对该通路TLR4、NF-κBp50及NF-κBp65蛋白的调控作用尚不明确;不同剂量芪药鸡金粥与相关指标的量效关系尚不明确,仍需进一步研究探讨。     

血管紧张素-Ⅱ活化肺微血管内皮细胞核因子-κB的研究

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子-κB(NF-κB)的活性的影响,以及经典途径在Ang Ⅱ介导的NF-κB活化过程中的作用.方法 本实验分为:Ang Ⅱ组:10-6 mol/L AngⅡ分别刺激HPMEC 0、0.5、1、2、4 h;氯沙坦组:10-6mol/L氯沙坦(AngⅡ 1型受体阻滞剂)预先处理HPMEC 1 h,再予相同10-6mol/L AngⅡ刺激细胞2 h,提取胞浆蛋白和胞核蛋白.凝胶电泳迁移率分析实验(EMSA)观察细胞中NF-κB的DNA结合活性.Western印迹检测细胞浆中抑制因子κBα(IκBα)的含量.结果 AngⅡ刺激HPMEC 0.5 h后细胞中NF-κB活性明显上升(144.5±16.1),在2h达到峰值(270.1±27.2),4 h(215.1±17.8)较2 h有所下降,但仍高于0 h水平,以上各时间点与AngⅡ刺激细胞0 h(100.0±25.1)相比,差异有统计学意义(P＜0.05).与Ang Ⅱ刺激HPMEC 0 h IκBα含量(44.4%±2.1%)相比,0.5 h后IκBα含量即开始明显下降(38.9%±3.6%,P＜0.05),2 h后IκBα含量下降最为明显(32.6%±2.3%,P＜0.05),4 h细胞中IκBα含量较2 h有所上升,但仍然明显低于ArgⅡ刺激0 h细胞中IκBα的含量(40.1%±4.7%,P＜0.05).氯沙坦组NF-κB活性(115.4±10.7)和IκBα含量(43.6%±3.7%)与AngⅡ组0 h相比无明显差异.氯沙坦组中NF-κB活性明显低于AngⅡ组2 h,氯沙坦组中iκBα的含量亦明显高于AngⅡ组2 h.结论 AugⅡ能通过AT1介导HPMEC中NF-κB活化.经典途径参与了AagⅡ诱导的HPMEC中NF-κB活化过程.     

IκBα在NF-κB信号通路中的作用及临床意义

核因子kappaB(NF-κB)抑制蛋白(IκB)是NF-κB信号通路中的重要成员,主要调节NF-κB的激活及转录。目前研究认为,IκBα是IκB家族中的重要成员之一,IκBα在所有真核生物的固有免疫和适应性免疫中均发挥作用,介导了多种感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤、基因病等的发生。本文对IκBα的结构、在信号通路中的作用、生物学功能、与免疫及感染相关疾病的关系进行综述。     

HMGB1、TNFAIP3蛋白对狼疮性肾炎系膜细胞增殖的影响及其NF-κB信号通路机制

目的 基于核因子-κB(NF-κB)信号通路研究高迁移率族蛋白1(HMGB1)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)对狼疮性肾炎(LN)肾小球系膜细胞(MC)增殖的影响。方法 分离、培养10只MRL-Faslpr/JNju小鼠(LN小鼠)的MC,将其分为空白对照组、溶剂对照组、HMGB1干预组。空白对照组不作任何处理,溶剂对照组加入200μg/L甲醇溶剂,HMGB1干预组加入200μg/L人重组HMGB1蛋白。采用CCK8法检测12、24、36、48 h时3组肾小球系膜细胞增殖率。采用免疫印迹法(Western Blotting)检测3组MC中HMGB1、TNFAIP3、NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)蛋白表达量。结果 12、24、36、48 h时,HMGB1干预组MC增殖率显著高于空白对照组、溶剂对照组(P 0. 05);HMGB1干预组MC增殖率随时间延长而显著升高(P 0. 05); HMGB1干预组MC中HMGB1、TNFAIP3、NF-κB蛋白表达量显著高于空白对照组、溶剂对照组(P 0. 05);干预组MC中IκB-α蛋白表达量显著低于空白对照组、溶剂对照组(P 0. 05);溶剂对照组MC增殖率及HMGB1、TNFAIP3、NF-κB、IκB-α蛋白表达量较空白对照组差异无统计学意义(P 0. 05)。结论 HMGB1可能通过上调TNFAIP3表达,诱发NF-κB信号通路活化,介导LNMC过度增殖,这可为LN的发病机制研究和靶向治疗提供理论基础。     

严重烫伤小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子α、蛋白激酶C的变化及调控

背景严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质.烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚.目的观察烧伤后不同时相点肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的变化及运用特异性调控剂H-7后小鼠腹腔巨噬细胞内核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活性及膜浆蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的变化,在信号转导的水平探讨PKC是否参与了巨噬细胞TNF-α的调控,阐明巨噬细胞功能紊乱的某些机制.设计以实验动物为研究对象的随机对照的实验研究.单位一所军医大学的烧伤研究所.材料实验于1999-01/12在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成.实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠,32只.方法以本所小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤.实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48 h6组.收集腹腔巨噬细胞.采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,同位素掺入测膜浆PKC活性.主要观察指标①检测TNF-α的含量.②测定NF-κB的活性.③检测膜浆PKC的活性.结果烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12 h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.92,P＜0.01).与正常对照组相比,伤后膜浆PKC活性升高,其中膜PKC活性于伤后2 h显著增高(t=7.930,P＜0.01),为(231.80±31.66)nmol/min·g.6h稍降,接近于正常(t=2.531,P＜0.05),为(174.29±16.80)nmol/min·g,12 h及24h迅速上升,至48h达到峰值(t=29.42,28.03,30.19,P＜0.01),分别为(512.10±33.42),(454.70±21.06)及(530.49±28.54)nmol/min·g.TNF-α和膜PKC的变化进行相关分析表明,二者呈显著的正相关(r=0.796 4,P＜0.05).EMSA图像显示,烫伤后NF-κB活性明显升高.以伤后12 h为调控点,经H-7作用后,NF-κB活性显著被抑制.结论烧伤后小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌及PKC,NF-κB的活性明显被激活,PKC-NF-κB信号通路参与了TNF-α表达的调控,为烧伤过程中免疫功能的调整及康复干预提供了实验学数据.     

严重烧伤后小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子的变化及免疫功能机制

背景严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质.烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚.目的观察严重烫伤后不同时相点及运用特异性NF-κB抑制剂吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)后小鼠腹腔巨噬细胞内NF-κB活性、IκB-α的表达及肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,从信号转导的角度探讨巨噬细胞功能紊乱的机制.设计随机对照的实验研究.单位创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室.材料实验于1999-01/06在第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成.实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠30只.干预以小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤.实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48 h组.收集腹腔巨噬细胞.采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,免疫印迹法测IκB-α的表达,反转录-PCR测TNF-α mRNA的表达.主要观察指标①检测TNF-α的含量.②测定NF-κB的活性.③检测IκB-α的表达.④测TNF-α mRNA的表达.结果烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12 h达到高峰,为(1 085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.92,P＜0.01).NF-κB活性于伤后明显活化,于2 h达到了高峰(t=13.31,P＜0.01),为(56.8±7.3)RDU,早于TNF-α的增多.与正常对照组相比,IκB-α的表达于烫伤后2 h显著下降(t=4.23,P＜0.01),达到0.632±0.086,以后上升,至24 h达到高峰(t=7.06,P＜0.01),为1.161±0.097,48 h稍降(t=4.82,P＜0.01),为1.149±0.167.以伤后12 h为调控点,予PDTC后NF-κB活性及TNF-α mRNA表达量均显著下降(P＜0.01).结论烫伤后NF-κB活性及TNF-α表达明显增强,IκB-α对NF-κB在高水平上维持着一种制约关系.烫伤后小鼠腹腔巨噬细胞内NF-κB信号途径参与TNF-α表达的调控.     

去甲斑蝥素通过NF-κB/IκBα途径增强阿霉素的抗骨髓瘤效应

目的 研究去甲斑蝥素(NCTD)联合阿霉素(ADR)对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 以U266细胞为研究对象,采用NCTD(10 μmol/L)和ADR(0.25 μmol/L)单独或联合处理细胞,MTT法观察细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测核因子-κB P65( NF-κB P65)、磷酸化NF-κB P65( p-NF-κB P65)、NF-κB抑制因子IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、survivin、Bcl-2和Bax蛋白水平,免疫组化法测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平.结果 ①NCTD能增强ADR的细胞毒和诱导凋亡作用,二者具有协同作用;②与ADR单药组比较,联合用药组胞核NF-κB P65和胞质p-IκBα的表达量分别由2.08±0.29和0.39±0.07降至0.48±0.08和0.02±0.01,胞质NF-κB P65和IκBα表达无变化;③联合用药组与ADR单药比较,survivin和Bcl-2的表达水平分别由0.31±0.05和0.23±0.05降至0.03±0.02和0.05±0.02,而Bax的表达由0.46±0.06升至0.62±0.08;④ADR组和联合用药组VEGF的阳性率分别为(44.6±4.4)％和(27.0±2.1)％,NCTD增强ADR对VEGF表达的抑制作用.结论 NCTD通过抑制NF-κB/IκBα途径,调节下游信号分子survivin、Bcl-2、Bax和VEGF的表达,增强ADR的抗骨髓瘤效应.     

利多卡因对肿瘤坏死因子α诱导中性粒细胞凋亡的影响

背景:利多卡因被认为有抗炎作用,而其作用机制不清.核转录因子κB是炎症反应的关键环节.目的:观察利多卡因对人体中性粒细胞核转录因子κB激活和中性粒细胞凋亡的影响.设计、时间及地点:对比观察,于2006-10/2007-02在江苏省麻醉学重点实验室完成.材料:肿瘤坏死因子α(O127:B8)购于Sigma公司;外周血标本健康者,受试者知情同意.方法:人体中性粒细胞分为5组:生理盐水对照组、肿瘤坏死因子α组、肿瘤坏死因子α+利多卡因1.0 mmol/L组、肿瘤坏死因子α+利多卡因2.0 mmol/L组、肿瘤坏死因子α+利多卡因4.0 mmol/L组,共同孵育3h.主要观察指标:以反转录聚合酶链反应及免疫印迹法检测利多卡因对核转录因子κBmRNA和I-κB mRNA表达及蛋白含量的影响.孵育12h和24h,以流式细胞术分析对中性粒细胞凋亡的影响.结果:利多卡因组核转录因子κB mRNA表达显著降低,而I-κB mRNA表达显著增加.并凡利多卡因2.0 mmoVL组和4.0 mmol/L组显著优于1.0 mmol/L组(P<0.05),而2.0 mmol/L组和4.0 mmol/L组之间差异不显著(P>0.05).利多卡因在12h和24h都可以显著抑制肿瘤坏死因子α诱导的外周血中性粒细胞凋亡(P<0.05),而4.0 mmol/L组显著优于1.0 mmol/L组(P<0.05).结论:利多卡因1.0,2.0,4.0 mmol/L都可以显著下调肿瘤坏死因子α诱导的外周血中性粒细胞P65mRNA的表达,并且在12和24h可以部分逆转肿瘤坏死因子α诱导的中性粒细胞凋亡.     

瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

背景:瘦素是脂肪组织分泌的一种多肽激素,研究显示瘦素在动脉粥样硬化形成中发挥了一定重要的作用。目的:观察瘦素对鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响,并从核转录因子κB活性变化角度探讨其可能机制。设计:对照观察实验。单位:华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系。材料:实验于2005-04/2006-02在华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系及附属协和医院普外科实验室完成。将培养的RAW264.7细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)、IkappaB激酶抑制剂组及空白对照组。每组3瓶,重复实验3次。方法:将鼠源性巨噬细胞株RAW264.7细胞以1×109L-1密度接种于6孔板中,用含体积分数为0.1的小牛血清的RPMI-1640培养基培养。待RAW264.7细胞生长至80%时,换用无血清培养基Opti-MEM继续培养24h后,将细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)及空白对照组,瘦素孵育4h后采用反转录-聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。上述分组细胞经瘦素分别孵育1,3,6和9h后采用双抗夹心酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α在蛋白水平的表达。上述分组细胞经瘦素孵育不同时间后采用凝胶迁移率实验检测细胞核内核转录因子κB活性。将RAW264.7细胞分为以下4组:空白对照组、IkappaB激酶特异性抑制剂PS1145(10μmol/L)处理组、瘦素(50μg/L)处理组、瘦素(50μg/L) PS1145(10μmol/L)组,各组孵育时间均为6h,分别检测细胞核内核转录因子κB活性及肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。主要观察指标:①不同浓度瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α:mRNA表达水平的影响;蛋白分泌的影响。②不同浓度瘦素对RAW264.7细胞核内核转录因子κB活性的影响。③抑制IkappaB激酶活性对瘦素诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的影响。结果:①RAW264.7细胞经不同浓度的瘦素处理后,肿瘤坏死因子α在mRNA水平呈瘦素剂量依赖性增加,50μg/L瘦素处理组达峰值。②蛋白水平的表达呈瘦素剂量时间依赖性增加,50μg/L瘦素处理6h即可达峰值。③核转录因子κB的活性亦与瘦素浓度正相关,50μg/L瘦素处理6h后核转录因子κB活性最高(P<0.05)。④抑制IkappaB激酶活性可部分抑制肿瘤坏死因子α的表达。结论:瘦素可直接促进RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的表达和分泌,并呈剂量时间依赖性,其机制可能与瘦素激活核转录因子κB有关。这可能是瘦素致动脉粥样硬化的机制之一。     

核因子κB对血管成形术后平滑肌细胞增殖和新生内膜形成的影响(英文)

背景:血管壁机械性损伤后的炎症和增殖效应是血管再狭窄的主要原因。核因子κB/Rel家族中的核因子κB在多种细胞类型中表达,激活一系列与血管壁病理生理相关的靶基因。目的:探讨核因子κB的反义和诱骗性寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖以及大鼠颈动脉球囊损伤后血管新生内膜和单核细胞化学趋化因子的作用。设计:随机对照动物实验。单位:上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科。材料:3个月龄雄性SD大鼠126只,350～380g。引物合成和寡核苷酸合成:根据文献及国际互联网cDNA文库检索、设计,由上海生物工程公司合成;寡核苷酸合成:全硫代修饰,由上海生物工程有限公司合成。方法:实验于2001-05/2003-03在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和瑞金医院心血管实验室完成。采用贴块法原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,实验选用3～5代血管平滑肌细胞。检测增殖的平滑肌细胞内增殖细胞核抗原和核因子κB蛋白水平。制作大鼠血管球囊损伤模型。SD大鼠随机分为7组,正常组:除球囊损伤外,其余手术操作同其他组相同;反义组;正义组;诱骗组;Scramble组;反义 诱骗组;模型组。每组分为6个时相点(6h,1,3,5,7,14d),每个时相点3只大鼠。检测血管球囊损伤后新生内膜形成以及单核细胞化学趋化因子1、核因子κB p65和ERK2的表达水平。主要观察指标:①核因子κB p65寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的效应。②核因子κB p65基因表达定位和蛋白合成。③大鼠颈动脉球囊损伤后病理形态学改变。④单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达。⑤免疫组织化学检测球囊损伤后血管壁单核细胞化学趋化因子1的蛋白质表达。⑥Western blot检测球囊损伤后血管壁核因子κB p65,ERK2的蛋白合成。结果:①增殖的平滑肌细胞内增殖标记物增殖细胞核抗原表达增加。②增殖的平滑肌细胞浆、细胞核内均有核因子κB p65的基因表达;核因子κB p65蛋白水平增加。观察核因子κB p65基因表达水平,反义核酸组较对照正义组降低53.66%,诱骗性寡核苷酸组较诱骗对照组降低57.35%,差异均有统计学意义(P<0.05)。③核因子κB反义和诱骗寡核苷酸抑制增殖细胞核抗原表达,较阳性对照组分别降低45.12%,45.05%。④大鼠血管球囊损伤后第5天,正义组、诱骗对照组、模型组内膜面积、中膜面积、内膜/中膜比值显著升高(P<0.05),7d后达到高峰。反义组、诱骗组显著降低内膜与中膜比值,反义 诱骗组较单独应用无统计学意义的降低效应。⑤反转录-聚合酶链反应显示球囊损伤后6h,单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达明显增加,1d后表达减少,3,5,7d单核细胞化学趋化因子1 mRNA持续而明显的表达增强,14d后略为降低。反义组、诱骗组、反义 诱骗组在各时间点均能减少单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达。⑥Western Blot检测显示血管球囊损伤后6h,核因子κB p65、ERK2蛋白表达微弱,1d后ERK2蛋白表达略增强,核因子κB的蛋白合成明显增强。7d后p65,ERK2的蛋白合成达到高峰。第14天,ERK2与p65的蛋白合成较第7天减弱。反义组、诱骗组、反义 诱骗组较模型组、正义组、诱骗对照组各时相点蛋白合成均减弱。结论:增殖的平滑肌细胞核因子κB p65基因表达增加,核因子κB调控单核细胞化学趋化因子1的基因表达和蛋白质水平。血管球囊损伤后,血管平滑肌细胞增殖有动态性变化。局部转染核因子κB反义和诱骗寡核苷酸能抑制所调控靶基因表达。     

急性心肌梗死患者低氧诱导因子-1α变化的临床研究

目的 本研究旨在通过测定急性ST段抬高性心肌梗死患者血中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)水平及急诊PCI术后的HIF-1α水平的变化,探讨HIF-1α水平与心肌梗死范围的关系以及心肌梗死患者HIF-1α水平演变和急诊PCI治疗对HIF-1α水平的影响.方法 入选急性ST段抬高性心肌梗死患者50例,按治疗方式分急诊经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术组(25例)和未行急诊PCI术组(25例);另设对照组(25例).两组急性心肌梗死患者均取入院后即刻、发病后9h、12h、24h、48h、168h等的外周静脉血;对照组仅取空腹血一次,用ELISA法测定HIF-1α水平.结果 对照组HIF-1α水平为(47.40±31.16)pg/mL;急诊PCI术组在入院即刻、发病后9h、12h的HIF-1α的水平均高于对照组,其水平随时间增加而递减;而在发病后24h,48h、168hhIF-1α的水平与对照组差异无统计学意义;非急诊PCI术组入院即刻、发病后9h、12h、24h的HIF-1α水平均高于对照组,以12h的HIF-1α达高峰;而发病后48h、168h的HIF-1α水平与对照组比较差异无统计学意义.结论 在急性ST段抬高性心肌梗死患者中,入院即刻HIF-1α水平与急性心肌梗死范围呈正相关;急性ST段抬高性心肌梗死患者非PCI组HIF-1α水平持续24h升高;急诊PCI术可显著降低HIF-1α水平.     

胎膜早破孕妇胎膜组织中NF-κB和MMP-9的表达及意义

目的通过检测胎膜组织中NF-κB和MMP-9蛋白的表达,分析其在胎膜早破(PROM)发病中的作用及相关性。方法①胎膜病理切片HE染色镜检,将病例分为绒毛膜羊膜炎组和非绒毛膜羊膜炎组;②采用免疫组化SP法检测32例PROM和20例正常孕妇胎膜组织中NF-κB和MMP-9的表达。结果①所有PROM胎膜标本,诊断为绒毛膜羊膜炎者占46.88%,正常组胎膜感染占10.00%。②PROM组胎膜组织中NF-κB、MMP-9表达明显高于对照组孕妇(P<0.05);绒毛膜羊膜炎组胎膜NF-κB、MMP-9表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组(P<0.05);胎膜中MMP-9阳性表达与NF-κBP65亚单位阳性表达采用线性相关分析成明显正相关关系(P<0.01)。结论NF-κB、MMP-9均参与了PROM的发病。MMP-9基因的表达受多功能核转录因子κB的调控。NF-κB活化可能是PROM发生的关键点。