鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

背景:研究表明,感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性,且能使细胞增殖旺盛,这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染,用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:与对照组、空载病毒组相比,基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染后人骨髓基质细胞的成骨分化

背景:现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法大致分为在化学药物作用、细胞因子作用以及转基因作用下的分化等.目的:观察腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和骨关节科完成.材料:人骨髓基质细胞取自健康成年男性自愿者.人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒、β半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒由课题组前期构建.方法:抽取健康志愿者髂前上棘骨髓,采用全骨髓法分离培养人骨髓基质细胞.体外扩增纯化后取50%融合的P2代细胞,随机分为4组:腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组向细胞培养液中加入人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒1×1010OPU/mL,孵育24 h后换为普通完全培养液继续培养.β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组加入半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒,其余处理与前组相同.阳性对照组向培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠.空白对照组仅加入普通完全培养液,不进行特殊处理.主要观察指标:全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性,免疫组化染色观察血管内皮生长因子的表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成.结果:处理后2周,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组与阳性对照组的培养上清碱性磷酸酶活性基本相似(P>0.05),而β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组的培养上清碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01).血管内皮生长因子主要在骨髓基质细胞的胞浆内表达,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组阳性细胞数明显多于其他3组.腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组和阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组.结论:基因重组腺相关病毒人血管内皮生长因子165转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用.     

重组反转录病毒碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人骨髓基质细胞成骨的影响

背景:国内外有关成纤维细胞生长因子基因转染促血管和促肌肉生长的研究较多,而成纤维细胞生长因子基因促成骨的研究未见报道。目的:观察重组反转录病毒retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养人骨髓基质细胞,体外扩增纯化后分为4组:①retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组:培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子基因重组反转录病毒。②retroviruspLXSN组:培养液中加入反转录病毒空载体。③阳性对照组:培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组:不给予特殊处理。结果与结论:经多次换液传代,人骨髓基质细胞呈均一梭形形态。处理后retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少。免疫组织化学染色见retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组碱性成纤维细胞生长因子表达明显强于其他3组。retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子和阳性对照组可引起细胞碱性磷酸酶活性增高和矿化结节及骨胶原形成。提示基因重组反转录病毒成纤维细胞生长因子转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用。     

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用,采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取P2代骨髓间充质干细胞,分为3组,正常培养组为对照组,其他2组分别转染重组腺病毒（Ad.bFGF-eGFP）及空病毒（Ad.eGFP）。相差显微镜观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞增殖曲线,ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型;碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组;ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化,增加增殖活力,促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的生物学特性及对血管生成的影响

背景:碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比.设计、时间及地点:对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成.材料:2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导.5周龄Wistar大鼠用于移植实验.牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠.方法:分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选.稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况.主要观察指标:碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较.结果:利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况.从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性.重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达.转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达.转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化.转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P＞0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P＜0.01).骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录.转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多.结论:稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想.外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因.     

慢病毒介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染促进半月板纤维软骨细胞的增殖与基质合成

目的:碱性成纤维细胞生长因子是一种作用广泛的修复始动因子,能有效地促进多种细胞的增殖和基质合成功能。借助慢病毒载体进行碱性成纤维细胞生长因子基因转染半月板纤维软骨细胞,观察半月板纤维软骨细胞的增殖与基质合成情况。方法:实验于2004-05/2005-11在上海市四肢显微外科实验室完成。①实验材料:ViraPower慢病毒载体系统;3个月龄新西兰大白兔3只。②实验过程和分组:分离培养兔半月板纤维软骨细胞,待培养的第1代细胞生长至60%融合时,将细胞与克隆有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体悬液共培养,定义为实验组细胞;同时设立对照组细胞,与不携带任何基因的慢病毒悬液共培养;空白组细胞,未接受外加处理。③转染后48h用酶联接免疫吸附剂测定方法检测3组半月板细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子的表达;激光流式细胞仪检测细胞周期,3H-脯氨酸摄入法检测胶原合成;转染后第2,4,6,8天用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖。结果:①与重组慢病毒共培养48h后,在实验组细胞培养液中检测到碱性成纤维细胞生长因子的表达,而对照组和空白组细胞的培养液中未能检测到碱性成纤维细胞生长因子的表达;共培养6d后实验组细胞吸光度高于对照组和空白组(P<0.01)。②实验组细胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的时间较对照组和空白组缩短(P<0.05)。③实验组细胞胶原高于对照组和空白组。结论:利用慢病毒转基因技术能有效地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入半月板纤维软骨细胞,继而促进半月板细胞的增殖和基质合成,有可能为治疗半月板损伤提供新的方法。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响

背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用。但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响。设计:单一样本观察。单位:青岛大学医学院附属医院眼科。材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表)。方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞。采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中。③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性。主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况。②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响。结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%。②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应。③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天最高达662.935ng/L。④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P<0.05)。⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P<0.01)。结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力。     

人血小板源性生长因子B基因转染对猫角膜内皮细胞增殖的影响

背景:许多研究显示外源性的人血小板源性生长B基因的转染可促进创伤的愈合.目的:用重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒转染和感染猫角膜内皮细胞,观察其对猫角膜内皮细胞增殖的影响.设计、时间及地点:分组对照观察细胞基因工程研究,于2007-01/11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:健康足月幼猫,体质量250～300 g,雌雄不限.重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒由青岛大学医学院附属医院中心实验室自行构建.方法:常规显微镜下撕取内皮培养法,培养出原代猫角膜内皮细胞,传2代的细胞用于实验.脂质体法将重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体转染到猫角膜内皮细胞中,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒采用直接感染法.实验分正常对照组、质粒对照组、重组质粒组、腺相关病毒对照组和重组腺相关病毒组.转基因24 h和48 h后收集细胞,Trizol试剂提取其总RNA.主要观察指标:通过荧光定量聚合酶链反应检测目的基因在细胞中的表达.四甲基偶氮唑盐法检测转基因48 h后细胞的增殖活性.结果:①撕取内皮法可方便获取到原代猫角膜内皮细胞.②自行设计的针对目的基因及内参基因的探针引物经扩增后电泳验证及序列测定证明特异性高.③转基因24 h和48 h后荧光定量聚合酶链反应检测人血小板源性生长因子B基因mRNA发现:正常对照组、真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组间差异无显著性意义(P>0.05):重组人血小板源性生长因子B基因真核表达质粒转染组和重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒实验组与正常对照组相比差异显著(P<0.05).④四甲基偶氮唑盐法检测显示重组质粒转染和重组病毒感染均可促进细胞增殖,真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组与正常对照组相比差异无显著性意义(P>0.05).结论:重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒可在角膜内皮细胞中高效表达并具有促进细胞增殖的活性.     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景:由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配,单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想,因此,应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度.目的:观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用.方法:全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞,分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞,设定感染复数值为5×104,观察两组细胞形态改变,分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定,比较两组成骨活性差异.结果与结论:人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后,细胞形态呈现典型的成骨改变,碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变.绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变.人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P<0.01).提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变.     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响(英文)

目的:研究己证实,碱性成纤维细胞生长因子刺激牙周膜细胞后可促进人牙周膜细胞的增殖,以利于重建丧失的牙周组织.利用不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子刺激体外培养的人正常牙周膜细胞,观察牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达.方法:采用胰酶消化法分离培养牙周膜细胞.取第3代对数生长期的细胞,加入含有10%二甲基亚砜和含体积分数20%胎牛血清冻存液的DMEM中进行冻存,第2天移入液氮中保存.免疫组织化学方法行抗波形丝蛋白、角蛋白染色鉴定.取第6代人牙周膜细胞,分为实验组和空白组.实验组分别用含质量浓度为0.1,1,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液标准条件下培养24 h;空白组用DMEM培养液标准条件下培养24 h.RT-PCR法检测细胞内核心蛋白多糖基因表达变化.结果:镜下观察空白组细胞未见明显变化,实验组可见细胞增殖,刺激前瓶底细胞较稀疏的区域变得密集了.加入碱性成纤维细胞生长冈了的牙周膜细胞内核心蛋白多糖的mRNA表达水平明显下降了,而且随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增加,抑制作用逐渐减弱,在0.1 μg/L时抑制作用最强,在10 μg/L时抑制作用最弱.结论:碱性成纤维细胞生长凶子刺激可促进牙周膜细胞增殖,呈剂量依赖性抑制核心蛋白多糖的合成,0.1 μg/L时抑制作用最强.     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用

背景：碱性成纤维细胞生长因子是具有多功能的细胞生长因子,对来源于中胚层及神经外胚层的细胞有明显的促进增殖作用。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人牙周膜细胞的作用。方法：将第5代人牙周膜细胞,以1×108 L-1的浓度分别接种到96孔板,随机分成4组,分别加入含0,1,10,100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。在第1,3,5,7天测定细胞的增殖情况,在第1,7天检测碱性磷酸酶活性。结果与结论：4组之间人牙周膜细胞增殖情况的差异有显著性意义（F=6.586,P=0.024）,随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增大,吸光度值均增大,其中100μg/L碱性成纤维细胞生长因子组的吸光度值均大于其他组（P 〈0.05）;碱性成纤维细胞生长因子各组的碱性磷酸酶活性均低于对照组（P=0.000）,浓度越大,活性越低（P 〈0.05）。结果显示碱性成纤维细胞生长因子在1-100μg/L范围内质量浓度越高,促进人牙周膜细胞增殖和抑制碱性磷酸酶活性的作用越强。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为（16±3）％。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22．65υg／L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

牙周膜干细胞成骨分化中细胞因子的作用

背景：牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞,具有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能。促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化有助于牙周疾病的治疗。目的：观察胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2对牙周膜干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：采用胶原酶消化人牙周膜组织,获得牙周膜干细胞,经体外鉴定、扩增后,通过倒置显微镜、苏木精-伊红染色、流式细胞仪对牙周膜干细胞进行生物学检测。分别在成骨细胞诱导培养液中加入成骨诱导液（对照组）及胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2持续诱导7,14d后,进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测,以及茜素红染色,并用实时定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因的表达情况。结果与结论：胰岛素样生长因子1刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节明显高于对照组,Runx2、Alp、col-1的mRNA呈高表达;成纤维细胞生长因子2刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节也高于对照组,Runx2、Alp、col-1的mRNA表达量也高于对照组。提示胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2在不同程度上促进体外培养的牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化。     

9型腺相关病毒转染乳鼠心肌细胞的可行性及安全性

背景:9型腺相关病毒对心肌细胞具有更好的靶向转染,是目前研究基因治疗心脏疾病的理想载体。目的:探索9型腺相关病毒体外转染乳鼠心肌细胞的可行性及对乳鼠心肌细胞的毒性评估。方法:分离培养原代乳鼠心肌细胞,以携带荧光蛋白基因的9型腺相关病毒为载体,将分离纯化的乳鼠心肌细胞分为正常培养组、无病毒转染组、病毒转染组。结果与结论:第1周细胞搏动频率及百分率正常培养组和病毒转染组与无病毒转染组比较,差异无显著性意义(P>0.05),但正常培养组高于病毒转染组(P<0.05);3周后各组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。经9型腺相关病毒转染的心肌细胞24h开始有表达,4~6d荧光最强,3组细胞72h内不同时间点还原比率均接近于1.0。说明9型腺相关病毒能成功有效地转染乳鼠心肌细胞,对乳鼠心肌细胞无明显毒性作用。     

9型腺相关病毒转染乳鼠心肌细胞的可行性及安全性

背景：9型腺相关病毒对心肌细胞具有更好的靶向转染,是目前研究基因治疗心脏疾病的理想载体。目的：探索9型腺相关病毒体外转染乳鼠心肌细胞的可行性及对乳鼠心肌细胞的毒性评估。方法：分离培养原代乳鼠心肌细胞,以携带荧光蛋白基因的9型腺相关病毒为载体,将分离纯化的乳鼠心肌细胞分为正常培养组、无病毒转染组、病毒转染组。结果与结论：第1周细胞搏动频率及百分率正常培养组和病毒转染组与无病毒转染组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）,但正常培养组高于病毒转染组（P〈0.05）;3周后各组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）。经9型腺相关病毒转染的心肌细胞24h开始有表达,4~6d荧光最强,3组细胞72h内不同时间点还原比率均接近于1.0。说明9型腺相关病毒能成功有效地转染乳鼠心肌细胞,对乳鼠心肌细胞无明显毒性作用。     

联合应用生长因子促骨髓间充质干细胞向韧带样细胞分化

背景：利用生长因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化成韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白是构建组织工程化韧带的关键。生长因子碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1在细胞定向分化过程中都起着十分重要的作用。目的：采用转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。采用10μg/L转化生长因子β1和25μg/L碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间质干细胞进行诱导分化,分为空白组、转化生长因子β1组、碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组。观察生长因子对骨髓间质干细胞生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比骨髓间质干细胞分泌胶原蛋白量。把转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合诱导的骨髓间质干细胞使用BrdU荧光染色标记,然后移植到脱细胞真皮基质上,观察细胞增殖分布情况,并与空白组对照。结果与结论：转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也较高。脱细胞真皮基质上,转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组细胞增殖分布情况明显优于空白组。提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激兔骨髓间质干细胞,能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34+造血干/祖细胞中的表达

目的 研究2型重组腺相关病毒（rAAV-2）介导的人凝血因子Ⅸ（hFⅨ）基因在脐血CD34^＋细胞及其子代细胞巾的表达。方法 采用rAAV-2／hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34^＋细胞，分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21d，从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达，同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响。结果 经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨ cDNA片段，上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达，每24h分泌量达14.10ng／10^6细胞．转导组和未转导组细胞培养21d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。结论 rAAV-2／hFⅨ能有效地转导人脐血CD34^＋细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ，且对其体外培养21d的细胞增殖分化能力无明显影响.