原代肾上皮细胞改良培养方法

背景:目前国内对上皮细胞的研究多采用细胞株的方式,但其离体时间长,细胞易产生变异,而原代培养则与体内状态更相近,希望能为组织工程肾脏相关研究提供肾上皮细胞来源.目的:探索原代肾上皮细胞培养的条件和方法.建立一套高效快捷的原代肾上皮细胞培养方案.设计、时间及地点:单一样本观察,开放性实验,于2007-12/2008-03在武汉大学病毒学国家重点实验室分子病毒与癌研究室完成.材料:新生2-4 d SPF级雄性SD大鼠鼠婴12只.方法:取SD大鼠,切取双侧肾脏组织,将其反复剪成约1 mm×1 mm×1 mm块,加入2.5 g/L的胰酶和0.4 g/L乙二胺四乙酸,放入37℃恒温水浴箱消化,30 min后移至200目钢网过滤,去除未消化组织块和细胞团,收集网下悬液1 000 dmin低温离心5 min,用DMEM(pH 7.2)培养基制成细胞悬液,以4×108L-1密度接种于培养瓶中,置CO2培养箱中培养.再将细胞悬液接种到一个培养瓶内,静止培养30min,镜下观察细胞部分贴壁,将培养液连同尚未J贴壁细胞一起吸到另一瓶内,继续培养,重复上述操作一次,纯化肾上皮细胞.主要观察指标:以4×108L-1密度接种于培养瓶中培养.用4 g/L锥虫蓝染色榆测肾上皮细胞的存活率,不着色者为存活细胞.并观察肾上皮细胞的形态学变化、贴壁率.结果:肾上皮细胞存活率为95.20%,4 h约60%的细胞贴壁,12 h 85%以上的细胞已经贴壁.24 h后肾上皮细胞伸出伪足呈梭形、多角形,具有胞核一两个,细胞大小均匀,生长迅速,三四天后形成细胞簇,最后肾上皮细胞连接成片生长.结论:该肾上皮细胞培养方法存活率、贴壁率高,是一种可靠的肾上皮细胞培养方法.     

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础.牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一.如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法.方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线.结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%).3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好.第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期.提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法.     

酶消化法获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的体外原代培养及其特征鉴定术

目的：建立成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的原代培养方法，为进一步观察其电生理特性提供目标细胞。方法：实验于2005-04／08在第三军医大学第一附属医院中心实验室完成。①细胞提取：取1～2个月龄成年豚鼠2只，雌雄不限。麻醉状态下处死，下腹部10g/L碘伏消毒后，即刻由腹部正中切15、于膀胱颈处取出膀胱，于解剖显微镜下仔细剔除膀胱外膜，纵行剖开膀胱、去除膀胱黏膜，将膀胱肌层置入含双抗的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min。将上述处理的肌层组织剪成1mm^3小块，在含双抗的磷酸盐缓冲溶液中漂洗2次；换入10g/L胶原酶P溶液，盖紧瓶盖，置入37℃培养箱中消化30min，完全消化溶解后，移入离心管中离心。②细胞培养：细胞沉淀中加入新鲜配制的达尔伯克（氏）改良培养基溶液（含体积分数为0．1的胎牛血清），吹打后按每瓶（容积25mL）含（25-30）&;#215;10^4活细胞接种在培养瓶内，37℃，体积分数为0．05的CO2孵箱内静置培养；细胞接种第2天，可见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁，平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶，孵箱内静置3d后，可见平滑肌细胞贴壁。③培养细胞的观察与鉴定：采用相差显微镜观察和免疫细胞化学方法鉴定。结果：①体外培养第2天可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起的细胞贴壁，该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性，平滑肌肌动蛋白染色阴性，确认为豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞。②逼尿肌细胞3d后贴壁，呈成纤维形生长，平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性，酪氨酸蛋白激酶受体染色阴性：结论：用酶消化法可获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞，并在体外条件下生长，可用于卡哈尔间质细胞样细胞的电生理特性观察。     

人支气管上皮细胞原代培养方法的对比研究

目的:探索简单有效的人支气管上皮细胞原代培养方法.方法:通过组织贴块法、蛋白酶消化 + 机械刮刷法、纤支镜刷检法分离获得人的支气管上皮细胞,用无血清培养基进行细胞培养.结果:组织贴块法可获得纯度高、存活率高、数量多的支气管上皮细胞,蛋白酶消化+机械刮刷法获得支气管上皮细胞中混杂较多的成纤维细胞,纤支镜刷检法获得的支气管上皮数量少且易老化,其中混杂大量的红细胞,影响上皮细胞的贴壁和生长.结论:组织贴块法是一种简便、有效的培养人的支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供满意的生长条件,提高上皮细胞的纯度,为进一步研究不同的呼吸系统疾病提供了良好的基础.     

兔膀胱移行上皮细胞的体外培养

目的:对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行上皮种子细胞的最佳培养方法。方法:实验于2005-09/2006-01在吉林大学药学院生物工程实验室完成。①取1月龄新西兰大耳白兔,耳缘静脉行空气栓塞处死,超净台内无菌取膀胱。②采用中性蛋白酶分离膀胱各层组织。③胰蛋白酶消化获得膀胱移行上皮细胞。④将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含体积分数为0.01,0.05,0.1血清的DMEM-F12培养液进行培养。④每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况;分别在第1,3,5,7,9天以四甲基偶氮唑盐法作细胞生长曲线。结果:①原代移行上皮细胞于接种后34～48h贴壁,培养六七天时可达80%融合,呈典型铺路石状。②传代后的细胞生长稳定快速,24～36h贴壁,五六天可达80%融合。③应用四甲基偶氮唑盐法检测不同体积分数血清对移行上皮细胞增殖的影响,显示膀胱移行上皮细胞在含有体积分数为0.05血清的DMEM-F12培养中生长状态最佳。结论:采用中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化法,对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,是一种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的：建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型，观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法：实验于2005-03／07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养：日本大耳兔20只，利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞，无血清生长因子培养基（成分：DMEM：Ham＇sF12为1：1，并加入以下激素及生长因子：10mg／L胰岛素、5mg／L转铁蛋白、20μg／L甲状腺素、0．4mg／L氢化可的松、7．5mg／L内皮细胞生长支持物、25μg／L表皮生长因子、1mmol／L-谷氨酰胺，100IU／mL青霉素，50mg／L链霉素）体外培养。②细胞纯度及鉴定：用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果：①气管上皮细胞的分离：酶低温消化加刷洗法获得的气管上皮细胞数量较多，呈圆形，较大，悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征：套皿接种细胞24h后，贴壁率约为60％，细胞增大，并进入分裂相。五六天后细胞增殖旺盛，部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长，在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃，第3周纤毛逐渐消失成遗迹，细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察：可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定：抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性，细胞达（91&;#177;3）％。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立兔气管纤毛上皮细胞的原代培养模型，具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养及鉴定

目的　探讨Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养方法 ,在形态学方面及晶体蛋白的特异性表达方面 ,对原代和第二代细胞进行鉴定。方法　在无菌条件下 ,取新生Wistar大鼠乳鼠晶体 ,解剖镜下剔除粘附的虹膜及悬韧带 ;室温条件下 ,于终浓度 0 0 8%的胰蛋白酶液中消化 5～ 10min后离心 ,用 199培养液调细胞至适当浓度 ,37℃ 5 %CO2 条件下培养 ,3～ 4d换液 1次 ;待细胞长成连续单层后 ,以 1∶2或 1∶3传代。结果　原代及第二代细胞形态呈典型的上皮细胞表型 ,从第三代起细胞形态发生了较大变化 ,提示细胞已开始分化。以Northern印渍杂交对培养细胞晶体蛋白的特异性表达进行了鉴定 ,发现原代及第二代细胞内仅存在α晶体蛋白mRNA。结论　原代和第二代细胞尚未进入分化状态 ,可用作进一步实验的材料。     

人肾小球系膜细胞原代培养方法的改进

背景:肾小球系膜细胞原代培养成功率低,生存时间短,传代次数少.其中分离提取肾小球一直是培养高纯肾小球系膜细胞的最大瓶颈.目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的人肾小球系膜细胞原代培养方法.方法:取自愿水囊引产的胎儿肾,采用肾皮质组织块法合优生选择法培养人肾小球系膜细胞.相差显微镜、透射电镜观察系膜细胞形态,免疫荧光技术鉴定细胞表型,激光共聚焦显微镜观察波形蛋白的表达.结果与结论:培养的肾小球系膜细胞呈梭形/不规则星形和细长形,胞质中各种细胞器丰富,细胞突起明显,胞膜上有很多微绒毛,细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白,而不表达细胞角蛋白、Ⅷ因子,激光共聚焦显微镜下发现系膜细胞波形蛋白表达阳性并具有特征性纤维束.说明培养的系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特征.肾皮质组织块法合优生选择法是一种简单、高效的培养人肾小球系膜细胞的方法.     

肾小管上皮细胞分离方法与原代培养

肾小管上皮细胞培养是研究肾脏疾病的一项重要技术,目前该细胞分离方法有酶分离法、化学分离法、筛网分离法、显微解剖分离法、流式细胞仪分离法、免疫分离法。本文就这些分离方法及所分离出细胞的性质做一综述。     

兔尿道上皮细胞的体外连续培养

背景:尿道损伤后的瘢痕挛缩或缺损可导致狭窄,寻找理想的修复替代材料已成为研究热点.目的:探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-04/2007-02在解放军总医院泌尿外科完成.材料:健康成年雄性新西兰雄兔6只,体质量3.0～3.5kg;实验用Dispase Ⅱ为美国Gibco公司产品.方法:取雄性新西兰兔尿道黏膜组织,分离上皮采用Dispase Ⅱ工作液,上皮细胞间的分离采用混合消化酶(1.25g/L胰蛋白酶与0.2g/L乙二胺四乙酸等体积混合)消化,以差速贴壁法排除成纤维细胞.使用DMEM与F123:1混合培养液加体积分数为0.1的胎牛血清,对上皮细胞进行原代单纯培养和传代培养;取第2～6代细胞进行上皮细胞的免疫组织化学染色,以正常尿道黏膜组织石蜡切片为阳性对照组,以成纤维细胞铺片为阴性对照组.主要观察指标:①利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态、生长、增殖情况.②采用活细胞荧光染色法观察细胞存活状态.③以扫描电镜观察细胞超微结构.④采用免疫组织化学染色行细胞鉴定.结果:①原代培养3-5d细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一.生长期内均为单一的上皮细胞,无成纤维细胞混杂生长,细胞可传9-10代.②第4～6代细胞在免疫荧光染色和超微结构观察中显示良好形态.③免疫组织化学证实角蛋白染色阳性.结论:应用组织工程技术,成功培养尿道上皮种子细胞.结果表明,细胞生长状态良好,增殖较快.经特异性免疫组织化学及形态学鉴定为纯化的尿道上皮细胞.     

犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难，尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。方法：获取犬小块阴道组织，机械分离阴道黏膜上皮，Dispase 酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞，接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代；机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞，在含体积分数10%胎牛血清的 DMEM 培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况，分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展，四五天后呈对数生长，七八天可达70%融合，为单一的上皮细胞，呈典型铺路石样，未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次，连续传代六七次，细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形，此后呈对数生长，4 d后融合呈典型的“峰和谷”样，每三四天可传代1次，连续传代七八次，细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实，犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养，可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。     

体外连续传代培养人腮腺腺上皮细胞的观察

实验于2004-11/2005-03在天津市口腔医院中心实验室完成。取材于一成年人腮腺良性肿瘤切除后弃用的正常腮腺组织。首先制备鼠尾胶原,取成年大白鼠2只,无菌条件下抽取鼠尾肌腱筋膜,收集浸泡在500mL1g/L的冰醋酸中,铺被时将胶原冰醋酸溶液浸润培养板和培养瓶底壁,与盛有氨水烧杯一同放置在一无菌器皿中,在37℃温箱中保存72h。然后采用酶消化法从腮腺组织分离培养腺上皮细胞,以鼠尾胶原作培养底物,在1∶1DMEM/F12培养基中加入胰岛素、异丙基肾上腺素、氢化考的松等生长刺激因子,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态学特征。结果表明腮腺上皮细胞原代培养4d时成极性排列,形成大小不等的腺腔与导管样结构。腮腺上皮细胞传代培养在50d的培养周期中传代至F3代,F3代细胞液氮冻存后复苏成活。苏木精-伊红染色见细胞体积较大,胞质丰富核膜清晰,1～2个核仁,部分可见核分裂相,无异常核分裂相。     

胎鼠肺泡Ⅱ型细胞的原代培养及鉴定

实验于2007-10/12在北京军区总医院附属八一儿童医院实验室完成.取孕19 d SD大鼠胎鼠肺组织进行原代培养,通过IgG包被瓶培养进行筛选纯化.分别于培养24,48,72 h后检测细胞的活力;利用共聚焦显微镜及电镜对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行鉴定.各时间点Ⅱ型细胞活力均在90%以上,细胞纯度在91%以上,电镜下细胞胞浆内含有丰富的板层小体,细胞表面有微绒毛:共聚焦显微镜下细胞浆中有呈绿色荧光的SP-C阳性表达.胰蛋白酶加胶原酶消化,IgG包被瓶进行筛选所得肺泡Ⅱ型细胞活力及纯度均较高,可以作为肺泡Ⅱ型细胞的原代培养的常规方法;电镜和免疫荧光均可达到鉴定目的.     

酶消化法获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的体外原代培养及其特征鉴定

目的:建立成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞的原代培养方法,为进一步观察其电生理特性提供目标细胞。方法:实验于2005-04/08在第三军医大学第一附属医院中心实验室完成。①细胞提取:取1～2个月龄成年豚鼠2只,雌雄不限。麻醉状态下处死,下腹部10g/L碘伏消毒后,即刻由腹部正中切口、于膀胱颈处取出膀胱,于解剖显微镜下仔细剔除膀胱外膜,纵行剖开膀胱、去除膀胱黏膜,将膀胱肌层置入含双抗的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min。将上述处理的肌层组织剪成1mm小块,在含双抗的磷酸盐缓冲溶液中漂洗2次;换3入10g/L胶原酶P溶液,盖紧瓶盖,置入37℃培养箱中消化30min,完全消化溶解后,移入离心管中离心。②细胞培养:细胞沉淀中加入新鲜配制的达尔伯克()氏改良培养基溶液(含体积分数为0.1的胎牛血清),吹打后按每瓶(容积25mL)含(25～30)×10活细胞接种在培养瓶4内,37℃,积分数为0.05的CO2孵箱内静置培养;细胞接种第2天,可体见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁,平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶,孵箱内静置3d后,可见平滑肌细胞贴壁。③培养细胞的观察与鉴定:采用相差显微镜观察和免疫细胞化学方法鉴定。结果:①体外培养第2天可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起的细胞贴壁,该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性,平滑肌肌动蛋白染色阴性,确认为豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞。②逼尿肌细胞3d后贴壁,呈成纤维形生长,平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性,酪氨酸蛋白激酶受体染色阴性。结论:用酶消化法可获得成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞样细胞,并在体外条件下生长,可用于卡哈尔间质细胞样细胞的电生理特性观察。     

羊膜上皮细胞的体外培养及干细胞特性研究

目的:体外分离培养人羊膜上皮细胞(hAECS)并探讨其生物学特性。方法:取足月产胎儿胎盘,无菌条件下将胎盘的羊膜层与绒毛膜层分离。将洗净的羊膜组织用眼科剪剪成约1mm×1mm大小,加入0.05%的含有0.53mMEDTA4Na的胰酶制备羊膜上皮细胞并进行培养。用免疫荧光、Westernblot等方法检测干细胞相关表面标记物(0CT-4、Nanog、SSEA-4)等的表达情况。结果:根据免疫荧光组织化学,Westernblot的结果显示,羊膜上皮细胞0CT-4、Nanog、ssea-4、Nestin表达阳性。结论:羊膜上皮细胞表达类似胚胎干细胞的表面标志物,可以作为干细胞的新来源。     

兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养

背景：组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的修复和重建开辟了新的途径,膀胱脱细胞基质是较好的泌尿系组织工程修复的替代材料。目的：构建毛囊干细胞与异种膀胱脱细胞基质为支架的细胞支架复合物,体外培养观察细胞在支架上的生长状态。方法：制备新西兰兔膀胱脱细胞基质,通过扫描电镜和Masson染色检测材料脱细胞效果,采用二次沉淀法将第3代毛囊干细胞静态接种于膀胱脱细胞基质表面,倒置显微镜下观察细胞生长状态,并绘制细胞生长曲线,组织学检测和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况。结果与结论：制备的膀胱脱细胞基质为白色半透明膜状,扫描电镜下观察为纤维网状结构,未见细胞残留。Masson染色提示膀胱脱细胞基质为胶原结构,无明显细胞残留。细胞材料体外复合培养48 h后倒置显微镜下观察膀胱脱细胞基质周围毛囊干细胞生长状态良好,1周后扫描电镜下观察毛囊干细胞伸展、黏附于支架表面。结果可见毛囊干细胞与膀胱脱细胞基质体外培养具有良好的生物相容性。