人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1：3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。     

人脐带基质干细胞体外向雌性生殖细胞分化的潜能

背景: 骨髓间充质干细胞具有向卵母细胞分化的潜能,但是其免疫排斥和来源的有限性限制了其应用.研究表明,脐带间质干细胞也具有分化为卵母样细胞的潜能.目的: 建立分离培养人脐带间质干细胞的方法,观察其在体外向生殖细胞分化的潜能.方法: 无菌条件下取正常足月分娩新生儿的脐带,用Ⅰ型胶原酶消化,分离单个核细胞,DMEM培养,获得贴壁细胞,流式细胞仪检测其免疫表型.采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成软骨方向分化.通过RT-PCR检测脐带间质干细胞中生殖系特异性标记物的表达,采用卵泡液作为条件培养基,体外诱导脐带间质干细胞向生殖细胞分化.结果与结论: ①分离的脐带单核细胞培养后呈纺锤体样,体外增殖达10代以上,其分子免疫表型为:CD29、CD44、CD73(SH3)、CD90、CD105(SH2)阳性;SSEA-4弱阳性:CD31、CD34、CD45、HLA-DR阴性,与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似.在不同的诱导条件下,脐带间质干细胞可形成脂滴、骨结节、软骨结节等结构,并表达脂肪、骨及软骨细胞相关的特异性基因.②脐带间质干细胞表达OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系标记物,在含5%,10%,20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下细胞可聚集分化形成卵母细胞样结构.     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化.目的:进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用.方法:取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞.通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白--Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况.结果与结论:从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达.结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化.     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景:动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞.目的:观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达.方法:采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定.取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化.结果与结论:采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化.     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景:成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系.目的:建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果.方法:分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达.不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况.结果与结论:全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能.     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.