不同方法提取血清总RNA的性能评价

目的 评价3种方法提取血清总RNA的性能.方法 分别用Trizol法、磁珠总RNA提取法(磁珠法)、柱式总RNA提取法(柱式法)提取血清总RNA.通过测定样品OD260/OD280值评价提取的总RNA纯度、产量;通过设计引物及TaqMan探针扩增总RNA的管家基因(GAPDH),以观察各方法提取的总RNA用于RT-PCR的效果.结果 3种方法提取总RNA纯度分别为Trizol法(1.83±0.19)、磁珠法(1.94±0.11)、柱式法(1.92±0.12);扩增管家基因GAPDH,其Ct值分别为Trizol法(19.37±3.51)、磁珠法(18.33±1.11)、柱式法(18.85±1.20).结论 磁珠法、柱式法明显优于Trizol法,磁珠法与柱式法结果 差异无统计学意义(P>0.05).     

纳米磁珠提取法在手足口病病原RNA提取中的应用

目的介绍纳米磁珠提取手足口病病原RNA的方法。方法手足口病患儿临床肛拭标本240份,分别以纳米磁珠提取法和经典的Trizol提取法提取RNA,以实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异核酸片段。结果纳米磁珠法检测EV71阳性率27.5%,CA16阳性率23.3%;Trizol法EV71阳性率26.6%,CA16阳性率22.1%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论纳米磁珠提取法操作简单,快速高效,适合临床实验室应用于手足口病快速诊断。     

改进Tripure法提取鉴定小鼠组织总RNA

目的改进从新鲜动物组织提取、鉴定纯度及完整性较高总RNA的技术方法。方法实验于2005-05-16/08-25在解放军第三军医大学大坪医院创伤分子生物学实验室进行。用健康4～6周龄昆明种小鼠70只,颈椎脱臼法处死,取肺组织约100mg。在TripureIsolation试剂说明书基础上,对提取组织RNA的操作步骤进行调整改进,包括:①迅速组织取材,可不将组织切割成碎块而直接中速匀浆。②匀浆头夹层每次使用前后一定要彻底清洗干净;新鲜组织使用5mL离心管匀浆。③吸取含RNA的三相分层上清液时,吸取250μL即可。④RNA沉淀后,用无水乙醇再洗1次。并对常规琼脂糖凝胶电泳做适当改进用于鉴定RNA的质量,改进的电泳方法:①电泳RNA所用器械均用肥皂水、体积分数为0.03的H2O2清洗2遍,1g/L焦碳酸二乙酯处理的灭菌双蒸水冲洗,室温晾干备用。②用新配的0.5×TBE配制10g/L琼脂糖凝胶,倒胶时Goldview核酸染料直接加入凝胶中。③琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经灭菌的0.5×TBE。电泳电压5V/cm,电泳时间1.5h后凝胶成像系统拍照记录。结果①取提取的总RNA5μg进行电泳1.5h后,可见28S,18S,5S3条清晰的RNA条带,其中28S条带的亮度约为18S条带的2倍,5S条带隐约可见。②用该法提取的新鲜组织RNA,经电泳鉴定及反转录-聚合酶链反应检测,显示RNA的纯度及模板性较好。全部操作过程可在2.5h内完成。结论用改进方法提取的新鲜组织RNA质量稳定,电泳鉴定快速可靠。     

一种组织总RNA的快速提取方法

ＲＮＡ提取和纯化技术的改进与完善历来为分子生物学者所重视 ,它不仅是研究ＲＮＡ分子结构与功能的必要条件 ,而且随着ＤＮＡ重组技术、ＤＮＡ自动测序技术、逆转录ＰＣＲ及其相关技术的迅猛发展 ,目前已成为测定蛋白质结构、筛选和研究新的功能基因的重要的不可缺少的手段。组织ＲＮＡ提取最常用的方法为异硫氰酸胍 -酸酚 -氯仿法 ,这种方法提取的总ＲＮＡ能满足一般逆转录ＰＣＲ需要 ,但对于一些要求严格的后继步骤则会严重影响结果 ,如差异显示ＰＣＲ ,由于其中混杂有少量ＤＮＡ而容易造成假阳性。我们在培养细胞ＲＮＡ快速提取方法的基…     

新型冠状病毒核酸提取方法的性能评价及临床应用

目的 评价3种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸提取方法的分析性能及临床应用价值.方法采用目前临床常用的裂解法、柱提法和磁珠法提取SARS-CoV-2核酸,通过实时荧光反转录聚合酶链反应及自建检测系统检测SARS-CoV-2核酸[开放阅读框(ORF)1ab、核衣壳蛋白(N)],评价3种核酸提取方法下的检测精密度、...     

几种提取生殖道常见病原菌DNA方法的比较

目的建立一种快速、有效提取生殖道常见病原菌DNA的方法。方法用3种方法分别提取念珠菌、淋病奈瑟氏菌、生殖支原体、阴道毛滴虫等生殖道常见病原菌的DNA,然后PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,比较3种DNA提取方法。结果蛋白酶K/SDS法提取DNA质量较好,PCR扩增条带也较清楚,但操作复杂,T riton X-100煮沸法虽提取质量不及蛋白酶K/SDS法,但简便快速。结论对于提取上述病原菌的临床分离株DNA除可采用蛋白酶K/SDS法外,还可采用T ri-ton X-100煮沸法进行提取,不宜采用SDS法提取念珠菌DNA。     

不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

背景：目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法,国内文献报道多为经典Trizol法,在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要。目的：探索不同方法提取SD大鼠软骨组织总RNA的区别。方法：选取3月龄SD大鼠9只,分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法对软骨组织进行总RNA提取,并通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,以探寻软骨总RNA最佳提取方案。结果与结论：Trizol法提取的RNA A260/A280值为1.58,说明纯度不高;RNAout法提取的RNA,由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原,也不能满足后续实验的需要;RNeasyMini Kit法和肝（Trizol）法提取RNA的A260/A280值分别为2.00和1.98,说明提取的总RNA或核酸的纯度高。RNA的完整性电泳结果显示,RNeasyMini Kit法、RNAout法和肝（Trizol）法可见28 s、18 s及5 s条带,而Trizol法未见任何条带,RNAout法28 s和18 s条带不清楚。结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,并能成功反转录合成双链c DNA,而RNAout试剂盒和经典Trizol法获得的总RNA不能满足后续实验需要。     

淋病奈瑟菌核酸的不同提取方法比较及评价

目的比较评价磁珠法、柱子吸附法和煮沸裂解法3种不同的核酸提取方法对淋病奈瑟菌(淋球菌)DNA提取效率的差异。方法对已确诊的淋球菌培养基挑取20个小菌落制成悬液,做1︰1～1︰100 000稀释度稀释,分别使用磁珠法、柱子吸附法和煮沸裂解法进行DNA提取,用实时荧光定量PCR对其提取效率进行评价。结果在不同浓度淋球菌的DNA提取中,以磁珠法的敏感性和重复性最高,而柱子吸附法和煮沸裂解法次之,<1×105copies/mL以下的拷贝数,3种DNA提取方法之间重复性和敏感性差异明显,磁珠法的提取效率最高,柱子吸附法次之,煮沸裂解法最差;>1×105copies/mL的细菌拷贝数的样本,3种方法差异随浓度增高不断缩小。结论磁珠法提取淋球菌DNA的效率、敏感性和重复性最高,在实际临床科研工作中,各实验室可根据自身实际情况选择不同的DNA提取方法。     

肺结核患者粪便TB-DNA提取方法的应用比较

目的比较煮沸裂解法、酚/氯仿法和试剂盒法3种DNA提取法在肺结核患者粪便标本中检测TB-DNA的应用效果。方法收集肺结核患者粪便标本,分别用煮沸裂解法、酚/氯仿法和试剂盒法提取DNA,比较其TB-DNA实时荧光聚合酶链反应(PCR)扩增的检测阳性率及扩增效率,分析不同方法的差异。结果对于痰抗酸涂片阴性患者的粪便标本,3种方法均未测到有TB-DNA扩增。痰抗酸涂片阳性患者的粪便标本,煮沸裂解法、酚/氯仿法和试剂盒法的TB-DNA检出率分别为45%、70%和80%。酚/氯仿法与试剂盒法TB-DNA的定量结果比较,存在显著性差异,试剂盒法提取扩增效果显著强于酚/氯仿法。结论试剂盒法可有效去除粪便标本中的PCR抑制物,TB-DNA检出率和定量结果明显优于煮沸裂解法和酚/氯仿法,对于无法产生痰或咳出痰的肺结核患者的实验室诊断具有较高的应用价值。     

Comparison of DNA and RNA extraction methods for mummified tissues

Nucleic acids extracted from mummified tissues are valuable materials for the study of ancient human beings. Significant difficulty in extracting nucleic acids from mummified tissues has been reported due to chemical modification and degradation. The goal of this study was to determine a method that is more efficient for DNA and RNA extraction from mummified tissues. Twelve mummy specimens were analyzed with 9 different nucleic acid extraction methods, including guanidium thiocyanate (GTC) and proteinase K/detergent based methods prepared in our laboratory or purchased. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase DNA and beta-actin RNA were used as markers for the presence of adequate DNA and RNA, respectively, for PCR and RT-PCR amplification. Our results show that 5 M GTC is more efficient of releasing nucleic acids from mummified tissue than proteinase K/detergent, and phenol/chloroform extraction with an additional chloroform step is more efficient than phenol/chloroform along. We were able to isolate DNAs from all 12 specimens and RNAs from 8 of 12 specimens, and the nucleic acids were sufficient for PCR and RT-PCR analysis. We further tested hepatitis viruses including hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis G virus, and TT virus DNA, and fail to detect these viruses in all 12 specimens.     

RNA稳定剂在显微切割抽提组织总RNA中的应用

随着人类基因组计划的完成以及cDNA微阵列等高通量技术的飞速发展 ,对特定组织细胞基因表达谱的研究 ,必需获取相应组织细胞的RNA ,显微切割为获取特定RNA提供了可靠的工具[1 ,2 ] 。不同于常规RNA抽提技术 ,显微切割需经过冷冻切片、HE染色和显微镜下切割等众多在常温下操作的     

四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

背景:由于在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中对DNA造成的损害,影响了后续的聚合酶链反应等研究.选择一种简便有效且经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法成为研究者们关注和亟待解决的问题.目的:比较甲醛固定石蜡包埋组织中4种提取DNA的方法对DNA质量的影响,探讨一种操作简便、污染少、经济实用的石蜡包埋组织中提取DNA的方法.方法:取手术切除的普通甲醛固定石蜡包埋的非小细胞肺癌组织标本20例,分别以二甲苯脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、试剂盒法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法提取其DNA,然后进行电泳分析、紫外分光光度计测定A260/A280比值及PCR扩增.结果与结论:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法可获得较大的DNA片段,且两种方法与试剂盒法所提取DNA的A260/A280值相比较,均有显著性意义(P<0.05),4种方法的提取效率差异无显著性意义(P>0.1),以改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法所得DNA为模板,扩增的目的条带亮度与阳性对照相当.结果证实改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法简便有效,所用试剂价格低廉,是一种经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法.     

石蜡包埋淋巴组织三种微量DNA提取方法的比较

目的为寻找一种高效、简便、实用的石蜡组织中DNA提取方法，本研究比较了三种不同的DNA提取方法对DNA质量的影响。方法选取淋巴相关组织的蜡块21例。三种DNA提取方法分别是简单消化煮沸法，酚／氯仿提纯法和试剂盒法。通过提取DNA的浓度和纯度、PCR扩增保守序列pglobin等方法，比较三种DNA提取方法的优劣。结果试剂盒法提取样品OD260／OD280平均比值位于1．6～1．8之间；提纯法位于1．3—1．5之间；简单消化煮沸法位于1，2—1．3之间。三种方法中，试剂盒法提取的DNA最为稳定。以3种DNA提取方法所获取DNA为模板，PCR扩增阳性率无统计学差异。结论从实用、快速、经济的角度综合分析，简单消化煮沸法简单快速，需要的组织样品少，是一个值得推荐的石蜡组织DNA提取方法。     

RNA extraction for RNA sequencing of archival renal tissues

Background: Next generation sequencing (NGS) and especially ribonucleic acid (RNA) sequencing is a powerful tool to acquire insights into molecular disease mechanisms. Therefore, it is of interest to optimize methods for RNA extraction from archival, formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissues. This is challenging due to RNA degradation and chemical modifications. The aim of this study was to find the most appropriate method to extract RNA from FFPE renal tissue to enable NGS.

Method: We evaluated seven commercially available RNA extraction kits: High Pure FFPE RNA Isolation (Roche), ExpressArt Clear FFPE RNAready (Amsbio), miRNeasy FFPE, RNeasy FFPE (Qiagen), PureLink FFPE Total RNA (Invitrogen), RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation (Ambion) and Absolutely RNA FFPE Kit (Agilent). RNA was obtained from tissue blocks of two healthy, male Wistar rats and from normal renal tissue of patients undergoing nephrectomy. Yield and quality of RNA extracted from rat whole kidney sections, human kidney core biopsies and laser capture microdissected (LCM) glomerular cross-sections were assessed: Analyses of RNA quantity were performed using NanoDrop and Qubit. RNA quality is reflected by DV200 values (% of RNA fragments >200 nucleotides) utilizing the Agilent 2100 BioAnalyzer. RNA of human LCM samples was subsequently sequenced using the Illumina TruSeq^® RNA Access Library Preparation Kit.

Conclusion: Total RNA can be extracted from archival renal biopsies in sufficient quality and quantity from one human kidney biopsy section and from around 100 LCM glomerular cross-sections to enable successful RNA library preparation and sequencing using commercially available RNA extraction kits.     

2种方法制备冷沉淀的质量分析

目的通过对冷藏融化法和水浴融化法制备冷沉淀的质量分析,选择合适的制备冷沉淀的方法。方法随机抽取2006年前后采用冷藏融化法和水浴融化法制备的冷沉淀各60份;利用血凝仪检测冷沉淀中FⅧ和Fg的含量,并计算FⅧ和Fg的合格率。结果冷藏融化法和水浴融化法的FⅧ含量(IU/袋)分别为:70.30±23.68,161.62±39.45;FⅧ合格率分别为:43.33%(26/60),93.33%(56/60),两者比较均有统计学差异(P<0.001)。Fg的含量(mg/袋)分别为:222.72±63.75,228.12±66.83;Fg合格率分别为:88.33%(53/60),91.67%(55/60),两者比较均无统计学差异(P>0.05)。结论水浴融化法制备冷沉淀简便、快速,Ⅷ合格率高,明显优于冷藏融化法,值得推广应用。     

单采与手工制备的新鲜冰冻血浆的质量比较

目的探讨单采和手工新鲜冰冻血浆(FFP)的质量差异。方法运用常规检验方法测定单采和手工FFP(各20份)的凝血因子(Fib及FⅧ)、部分生化指标(TP、LDH、K+、Na+及Cl-)、游离血红蛋白(FHb)及pH,并进行对比分析。结果 2种冰冻血浆FHb、K+、Na+、Cl-及Plt含量差异具统计学意义,其他检测指标在两者间差异不具统计学意义,单采FFPFⅧ活性比手工FFP略高。结论单采与手工FFP具有相同的质量,单采FFP的凝血因子活性略优于手工FFP。     

真菌DNA提取方法的建立和比较燃

目的：DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度严重影响实验结果，同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA，其纯度和提取率有很大差异。以丝状真菌为材料，进行DNA提取，对真菌DNA的提取方法进行优化，探讨其最佳DNA提取方法。 方法：实验于2004—06／2006—12在吉林大学基础医学院真菌实验室进行。以临床常见致病真菌标本为材料，采用玻璃珠-盐析法、CTAB法、Gene TLE^TM法3种不同方法提取DNA，通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取DNA的效率。 结果：同等菌体量下，A260和A80的比值采用Gene TLE^TM法获得的样品最高，表明其蛋白质含量相对最少。3种提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图都在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段，Gene TLE^TM DNA抽提法带型最清楚、明亮。 结论：Gene TLE^TM法提取DNA效率高、质量好，操作简单，适于DNA的提取.