白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性.目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-R细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成.材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdlL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建.方法:分离培养SD大鼠骨髓间允质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:以反转录聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达. 结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Westem Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达.结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞.     

人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明,白细胞介素12是一种强有力的抗肿瘤细胞因子,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,因此,利用携带白细胞介素12基因的间充质干细胞对于肿瘤的治疗具有极大的发展前景.目的:构建人白细胞介素12 5型腺病毒载体(Ad hIL-12),感染人骨髓间充质干细胞,检测白细胞介素12的表达.方法:提取成熟的树突状细胞的总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒.采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12.Ad hIL-12感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使细胞失去增殖能力,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中白细胞介素12的水平.结果与结论:经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882(762 bp)和NM_002187(987 bp)提供的序列完全一致.用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染人骨髓间充质干细胞后可持续高水平分泌白细胞介素12,在以人骨髓间充质干细胞为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景.     

构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体

背景：如何将树突状细胞和T细胞活化因子运送至肿瘤局部是有待解决的难题之一。利用人骨髓问充质干细胞具有肿瘤趋向性和低免疫原性的特性,将树突状细胞和T细胞活化因子导入骨髓间充质干细胞后运送至肿瘤局部表达可能是解决上述难题的方案之一。目的：构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的5型腺病毒载体（Ad5GM-CSF-IL-2）,感染人骨髓间充质干细胞,检测粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的表达水平和持续时间,为体内活化树突状细胞和T细胞提供实验依据。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA,以此为模板用RT-PCR方法扩增粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2基因cDNA,PCR扩增片段分别插入pcDNA3．1／Myc-His（-）B真核表达载体中,再利用脑心肌炎病毒内部核酸进入位点（IRES）序列,构建腺病毒载体穿梭质粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2。采用AdMax^TMFLP重组腺病毒载体体系,将穿梭质粒pDC515GM-CSF-IRES-IL-2与pBGHfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad5GM-CSF-IL-2。Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后经v射线照射使其失去增殖能力,分别用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2ELISA试剂盒在不同的时间点检测细胞上清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2蛋白的水平。结果与结论：经测序证实,克隆获得的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素2的cDNA序列分别与GenBank NM_000758（435bp）和GenBank NM_000586（462bp）提供的序列完全一致。用AdMax^TMFLP重组腺病毒载体可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2两个基因,均获得高效表达。Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后可连续7d高水平地分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生.目的:应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用.方法:构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达.重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用.结果与结论:①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达.②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化.③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应.     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和（或）外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化（钙）结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因,分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定;后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数,测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达,以β-肌动蛋白为内参照,未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达,以未感染组为对照。结果:①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达,未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达,未感染组呈阴性表达。结论:成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒,证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达,为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞

背景:钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,可促进细胞的黏附性能.利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,有望实现多能干细胞的成骨定向分化,并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用.目的:拟采用腺病毒为载体,介导钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞,观察两基因的表达情况.设计、时间及地点;细胞-基因学实验,于2008-08在珠江医院中心实验室完成.材料:人骨髓间充质干细胞来源于1例胸椎骨折男性患者,由珠江医院提供,患者对实验知情同意.钙黏蛋白11全长cDNA质粒由日本神户理研Riken分子生物中心Takeichi教授惠赠,全长核心结合因子α1基因质粒由美国Baylor医学院Ducy博士提供,pAdeasy腺病毒系统由美国约翰霍普金斯遗传所Bert博士馈赠.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞.利用PCR技术获得钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因,分别构建到腺病毒穿梭载体上,然后分别通过同源重组获得重组腺病毒质粒,再将两病毒质粒包装获得重组病毒液,最后通过病毒将两基因导入骨髓间充质干细胞.主要观察指标:Western blot法检测钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因在入骨髓间充质干细胞中的表达.结果:获得携带钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因的病毒液,将其感染人骨髓间充质干细胞后,以Wastern blot检测两种基因同时获得高表达.结论:实验成功构建钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因腺病毒载体,通过病毒转染入骨髓间充质干细胞,二者获得高效表达.     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用.目的:观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征.设计、时间及地点:细胞一基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成.材料:Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组.主要观察指标:通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化.结果:未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250-500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同.转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达.全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCI后,内向的起搏电流即被明显抑制:未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流.结论:通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流.     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒（Ad-ADM）,实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%～60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADMmRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

背景：人低氧诱导因子1α可调控其下游成骨及成血管基因的表达,具有提高成骨活性的作用。目的：观察携带人低氧诱导因子1α慢病毒感染的大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因表达情况。方法：通过RT-PCR方法从Hela细胞中获得低氧诱导因子1α,构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒表达质粒Lenti-HIF-1α-eGFP,与LentiPac HIV混合包装质粒共包装293Ta细胞,获得病毒;采用全骨髓直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,使用流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行鉴定。分别在慢病毒感染骨髓间充质干细胞1,4,7,14 d后,用实时荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。结果与结论：Lenti-HIF-1α-eGFP有效地感染骨髓间充质干细胞,实时荧光定量PCR检测结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶在Lenti-HIF-1α-eGFP感染后第4天开始明显过表达,且持续至14 d。结果表明低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞的成骨活性。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

pIRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的持续表达

背景:重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。目的:观察转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:ELISA结果显示,随着pIRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓间充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10～12d达高峰,转染后15d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。     

重组转化生长因子β1腺相关病毒感染骨髓基质干细胞的活性

背景：目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用。应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少。目的：构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性。方法：PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定。并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性。结果与结论：转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3Kb附近转化生长因子β1条带。收获病毒滴度5.2×1011v.g/mL。鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功。重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%。结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞。