碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞结合骨形态发生蛋白促进兔椎间关节的融合

背景：研究表明，骨髓间充质干细胞经骨形态发生蛋白诱导可分化为成骨细胞。目的：应用骨髓间充质干细胞、牛骨形态发生蛋白与纤维蛋自胶混合物作为骨移植材料，通过与单纯使用纤维蛋白胶、牛骨形态发生蛋白和骨髓间充质干细胞比较来评价这种移植材料的成骨效果。设计：对比观察实验。单位：广东省第二人民医院，中山大学附属第二医院。材料：实验于2004-01／2006-06在中山大学附属第二医院完成。健康新西兰大白兔由中山大学医学院动物实验中心提供。方法：自兔髂骨抽取骨髓，采用密度梯度离心法在体外培养扩增自体骨髓间充质干细胞。在纤维蛋白胶内加入骨形态发生蛋白制成复合物，再加入骨髓间充质干细胞制成另一种复合物。对12只新西兰大白兔经腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术。每只动物取L3-6 3个椎间隙随机接受4种移植方法中的3种：骨髓间充质干细胞＋骨形态发生蛋白＋纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞＋纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白＋纤维蛋白胶、纤维蛋白胶。术后3月利用放射学和组织学方法观察分析脊柱融合情况。主要观察指标：兔脊柱椎间隙骨痂形成情况。结果：①术后12周时，骨髓间充质干细胞＋骨形态发生蛋白＋纤维蛋白胶组椎间隙骨痂形成明显较其它组多，组织学上有连续的骨痂形成。骨髓间充质干细胞＋纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白＋纤维蛋白胶组可见前纵韧带后方有编织骨形成，骨量少，不连续。纤维蛋白胶组见纤维组织增生及少量成骨细胞，未见新骨形成。各组均未见纤维蛋白胶残留，椎间盘中有少量椎间盘髓核残余、中间有少量软骨组织形成。②12周时X射线检查显示，各组兔均未造成椎体后缘增生，无椎管狭窄。骨髓间充质干细胞＋纤维蛋白胶组节段活动度与骨形态发生蛋白＋纤维蛋白胶组、纤维蛋白胶组差异显著（P〈0．05）；各组间椎体后缘高度丢失差异不显著。结论：自体骨髓间充质干细胞、纤维蛋白胶和骨形态发性蛋白复合体可在椎间关节形成骨性骨痂，融合效果好，组织学方面评价也较其他方法好。     

血管内皮细胞生长因子/骨形态发生蛋白2联合修饰骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死

背景:将血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白二者联合修复坏死骨,有可能在保持种子细胞成骨表型的同时,又能持续高效地分泌血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2,从而有效促进血管再生,促进组织工程化骨组织的形成和再血管化。目的:观察血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2体外修饰骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死效果。方法:建立兔右侧股骨头缺血性坏死模型,并以抽签法随机分为3组:单纯髓芯减压组、髓芯减压+骨髓间充质干细胞组、髓芯减压+血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组。关节镜监视下将坏死骨清除,组织学检查成骨及血管生成情况。结果与结论:通过关节镜观察显示各组坏死骨清除干净,有新鲜血流出。组织形态学检测发现,髓芯减压+血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组移植后不同时间点血管数量及修复区新骨面积比显著高于单纯髓芯减压组、髓芯减压+骨髓间充质干细胞组(P<0.05)。提示血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2基因转染加强了骨髓间充质干细胞成骨作用,提高了新生骨的数量与质量,加快了股骨头缺血性坏死的修复。     

生物玻璃活性陶瓷复合人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓间充质干细胞修复颅骨缺损

背景:目前已有将体外培养的骨髓来源间充质细胞与支架复合后修复骨缺损的临床报道,但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用,其原位的成骨作用并不十分理想.目的:观察人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用.方法:复苏冻存的人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞,与生物活性玻璃陶瓷复合培养获得人工植骨材料;制备兔双侧颅骨全层骨缺损模型,实验组将人工植骨材料植入骨缺损区,并设置空白质粒转染的骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、空白组作对照,术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织化学检测和生物化学检测.结果与结论:转染人骨形态发生蛋白2的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养的人工植骨材料植入后第4周,骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填;第12周,完全被高密度阴影充填;第8周,骨小梁大部分相连成片;第12周,骨小梁粗大,骨髓再生.生物化学检测结果与组织化学检测结果一致,并且成骨效果及成骨活性明显优于对照组.说明携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合构成的人工植骨材料基本符合骨组织工程学的要求,在骨缺损区原位具有良好的成骨作用.     

99Tcm-MDP骨显像监测可注射组织工程骨的成骨活性

背景:有关牵张成骨传统的新骨生长形态观察方法如超声、X 射线、CT文献报道较多,但有关核素监测的报道较少.目的:探讨经皮注射可注射组织工程骨促进牵张间隙成骨的可行性及放射性核素骨显像对其的早期监测作用.方法:将20只日本大耳白兔以随机数字表法分为实验组和对照组,两组均于右胫骨中下段造成20 mm的骨缺损,干骺端截骨.7 d后延长,1 mm/次、1次/d.造模前实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第2代后诱导成骨.延长达靶位点后,实验组牵张间隙内注射自体干细胞悬液,并同时注射自体富血小板血浆;而对照组只注射等量生理盐水.采用核素骨显像监测移植后2,4,8周时成骨情况.结果与结论:放射性骨显像99Tcm-MDP注入3 h后,实验组与对照组可见显像剂明显沉积于牵张间隙区,均较对侧健性部位显影强.骨骼、肾及膀胱显像清楚,骨/软组织的对比度清晰,各组均可见大关节及肌腱附着处有对称性放射性增高区.两组在2,4周时牵张间隙放射性聚集呈现出上升的趋势,实验组上升趋势更为显著;8周时实验组和对照组核素浓聚变弱,但两者差异仍有显著性意义(P < 0.01).结果说明经皮注射移植复合富血小板血浆的可注射组织工程骨能够促进牵张间隙成骨能力,缩短成骨时间.放射性核素骨显像在早期修复过程有比较灵敏的监测效果.     

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。方法:将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组:分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组:以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。结果与结论:转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P<0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P<0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P<0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P<0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P<0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

血管内皮细胞生长因子/骨形态发生蛋白2联合修饰骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死

背景：将血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白二者联合修复坏死骨,有可能在保持种子细胞成骨表型的同时,又能持续高效地分泌血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2,从而有效促进血管再生,促进组织工程化骨组织的形成和再血管化。目的：观察血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2体外修饰骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死效果。方法：建立兔右侧股骨头缺血性坏死模型,并以抽签法随机分为3组：单纯髓芯减压组、髓芯减压＋骨髓间充质干细胞组、髓芯减压＋血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组。关节镜监视下将坏死骨清除,组织学检查成骨及血管生成情况。结果与结论：通过关节镜观察显示各组坏死骨清除干净,有新鲜血流出。组织形态学检测发现,髓芯减压＋血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2转染骨髓间充质干细胞组移植后不同时间点血管数量及修复区新骨面积比显著高于单纯髓芯减压组、髓芯减压＋骨髓间充质干细胞组（P〈0.05）。提示血管内皮细胞生长因子165/骨形态发生蛋白2基因转染加强了骨髓间充质干细胞成骨作用,提高了新生骨的数量与质量,加快了股骨头缺血性坏死的修复。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

99）Tcm-MDP骨显像监测可注射组织工程骨的成骨活性

背景：有关牵张成骨传统的新骨生长形态观察方法如超声、X射线、CT文献报道较多,但有关核素监测的报道较少。目的：探讨经皮注射可注射组织工程骨促进牵张间隙成骨的可行性及放射性核素骨显像对其的早期监测作用。方法：将20只日本大耳白兔以随机数字表法分为实验组和对照组,两组均于右胫骨中下段造成20mm的骨缺损,干骺端截骨。7d后延长,1mm/次、1次/d。造模前实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第2代后诱导成骨。延长达靶位点后,实验组牵张间隙内注射自体干细胞悬液,并同时注射自体富血小板血浆;而对照组只注射等量生理盐水。采用核素骨显像监测移植后2,4,8周时成骨情况。结果与结论：放射性骨显像99Tcm-MDP注入3h后,实验组与对照组可见显像剂明显沉积于牵张间隙区,均较对侧健性部位显影强。骨骼、肾及膀胱显像清楚,骨/软组织的对比度清晰,各组均可见大关节及肌腱附着处有对称性放射性增高区。两组在2,4周时牵张间隙放射性聚集呈现出上升的趋势,实验组上升趋势更为显著;8周时实验组和对照组核素浓聚变弱,但两者差异仍有显著性意义（P〈0.01）。结果说明经皮注射移植复合富血小板血浆的可注射组织工程骨能够促进牵张间隙成骨能力,缩短成骨时间。放射性核素骨显像在早期修复过程有比较灵敏的监测效果。     

本期专题：骨髓间充质干细胞与骨缺损修复

1经动脉骨髓间充质干细胞移植联合普伐他汀治疗早期股骨头缺血性坏死--见2010年14卷40期7568页。 2自体骨髓间充质干细胞动脉灌注联合局部注射治疗股骨头坏死--见2011年15卷6期1065页。 3血管内皮细胞生长因子/骨形态发生蛋白2联合修饰骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死--见2011年15卷1期37页。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2／注射式硫酸钙载体上的成骨

背景：将生长因子女合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。目的：脱察骨形态发生蛋白2／注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液,分3组培养：实验组将细胞悬液滴加剑骨形态发生蛋白2,注射式硫酸钙复合材料表面,对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2,空白对照组正常培养。结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多,实验组细胞数量最多,明显多于对照组及空白对照组（P〈0．05）。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组（P〈0．05）。体外实验显示骨形态发生蛋白2,注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

体外构建腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石的植骨材料

背景:随着组织工程和基因工程技术迅速发展,基因增强的组织工程骨为临床治疗骨缺损带来美好的前景.目的:观察经腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体(Ad-BMP-2)转染后的兔骨髓间充质干细胞在纳米羟基磷灰石植骨材料上的黏附、增殖及骨形态发生蛋白2的表达情况.方法:用Ad-BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞,免疫组化、蛋白印迹法检测转染后细胞内骨形态发生蛋白2的表达情况.将转染48 h的细胞均匀接种到纳米羟基磷灰石植骨材料上,扫描电镜观察细胞黏附状况,并采用MTT比色法测定骨髓间充质干细胞的增殖情况;消化收集黏附植骨材料上第3,5,7天的细胞,蛋白印迹检测黏附材料上细胞骨形态发生蛋白2的表达.结果与结论:转染后,骨髓间充质干细胞内骨形态发生蛋白2有高表达;扫描电镜见转染细胞在纳米羟基磷灰石材料孔隙周围及孔隙内黏附生长良好并大量增殖,MTT分析结果显示,纳米羟基磷灰石对骨髓间充质于细胞的体外增殖无抑制作用,复合后骨形态发生蛋白2有较高表达.结果表明经Ad-BMP-2转染后的骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石植骨材料生物相容性好,细胞在材料上能稳定长效地分泌骨形态发生蛋白2.     

pIRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的持续表达

背景:重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。目的:观察转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:ELISA结果显示,随着pIRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓间充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10～12d达高峰,转染后15d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

脂联素对兔下颌快速牵张成骨的影响

背景:脂联素可参与骨代谢及成血管过程,但目前关于脂联素对牵张成骨有无促进作用尚不清楚。目的:通过建立兔下颌快速牵张动物模型,探讨局部应用脂联素对骨牵张新骨再生的影响。方法:16只新西兰大白兔随机摸球法均分为对照组及实验组,建立兔下颌单侧快速牵张模型,牵张速率为2mm/d。在牵张开始的1,3,5d,对照组及实验组分别于牵张间隙注入200μL磷酸盐缓冲液或含有2μg重组人脂联素的磷酸盐缓冲液。结果与结论:两组动物牵张间隙内均可观察到新骨生成,组织学及显微CT检查显示实验组的新骨生成与钙化明显高于对照组。实验结果显示局部应用脂联素可有效促进兔下颌快速骨牵张的新骨再生。     

壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2复合骨髓间充质干细胞促进兔脊柱的融合

背景:前期实验已经证明壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2复合材料能够促进兔脊柱融合。目的:评价壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2/碱性成纤维细胞生长因子支架材料在兔椎间融合中的应用效果。方法:制备壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2/碱性成纤维细胞生长因子支架材料,并与大鼠骨髓间充质干细胞在体外构成组织工程骨。摘除40只新西兰大白兔椎间盘,随机分为4组:空白对照组未植入任何材料,对照组植入自体髂骨,支架材料组植入壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2/碱性成纤维细胞生长因子复合材料,实验组植入组织工程骨材料。结果与结论:术后12周:①X射线片:对照组与实验组椎体融合,两组间融合节段生物力学强度大致相同,生物力学强度高于空白对照组与支架材料组(P<0.05),且支架材料组高于空白对照组(P<0.05)。②组织学切片:实验组与对照组有编织骨岛和新生毛细血管生成,支架材料组仅观察到壳聚糖支架网络,空白对照组未发现特殊组织结构。表明壳聚糖-磷酸钙/骨形态发生蛋白2/碱性成纤维细胞生长因子复合鼠骨髓间充质干细胞能够明显促进脊柱融合。     

以海藻酸盐及异种骨复合技术制备组织工程化骨及体内成骨(英文)

背景:海藻酸有相对温和的凝胶条件与良好的生物相容性,已广泛应用于生物组织工程.目的:采用海藻酸钠凝胶复合异种骨的方法,构建骨组织工程载体,观察载体中细胞的生物性能及体内成骨能力.方法:取2只2周龄新西兰兔的骨髓,以1 ×10~(-8)mol/L重组人骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞.取诱导后第2代骨髓间充质干细胞接种于1%海藻酸钠凝胶中,培养4 d苏木精-伊红染色观察凝胶中细胞形态.将第2代骨髓间充质干细胞分为单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组,分别培养7 d后行骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色观察.取24只裸鼠,随机分为2组,于两侧股部肌袋中分别植入骨髓间充质干细胞,海藻酸钠凝胶/牛松质骨复合体作为实验组,骨髓间充质干细胞,牛松质骨复合体作为对照组.术后2,4周后组织学观察复合体成骨情况,图像分析系统分析各组成骨或软骨的面积百分比.结果与结论:海藻酸钠凝胶中骨髓间充质干细胞形态饱满,细胞悬浮于凝胶中,可见细胞分裂和核分裂相.单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组免疫组织化学观察,细胞分裂增殖正常,伸出多种形态的突起,胞核大,核仁清晰.单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组的骨形态发生蛋白2表达阳性率差异无显著性意义(P>0.05).扫描电镜观察海藻酸钠凝胶均匀地复合于牛松质骨微孔中,不同平面均有细胞生长.动物实验显示术后2,4周实验组和对照组的成骨或软骨的面积百分比差异有显著性意义(P<0.05).提示以海藻酸钠凝胶,牛松质骨构建骨组织工程载体,合乎组织工程载体的超结构原理,能最大限度地承载细胞,生物性能好,对骨髓间充质干细胞增殖和成骨表型及相关的生物性能无不良影响,在体内成骨效率较高.     

plRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的持续表达

背景：重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。目的：观察转染plRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓问充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。方法：全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒plRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：ELISA结果显示,随着plRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓问充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10-12d达高峰,转染后15d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染plRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。方法:将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2cNDA和人成纤维细胞生长因子2cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Westerblot方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果与结论:转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。