无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

背景：以含血清培养基培养的脐带间充质干细胞,存在着进一步应用的障碍。目的：建立无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞。方法：取脐带华通氏胶(Wharton’s Jel y),采用机械法将组织胶切碎,1-3 mm3大小,分别培养到含胎牛血清完全培养液中以及无血清培养液中。培养第11,14,17天收获细胞并进行相关检测。在符合2006年制定的干细胞最低评估标准的基础上,以集落形成单元指标评估何种培养体系能获得较多高质量的原代细胞。结果与结论：无血清培养体系相对于经典的含血清的培养体系而言,细胞生长速度更快。另外,培养第11天,集落形成实验表明无血清培养体系下能获得更多的集落。因此,无血清培养体系可以保持间充质干细胞的特性,为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养,血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞,以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以 IMDM 为基础培养基,添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基;以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,以3000/cm2的浓度进行传代培养,待细胞扩增至P5代后,进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测,并比较两者之间的差别。结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长,有更高的细胞累积群倍数;克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义,流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型,体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力,但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.     

脐血间充质干细胞的适宜培养条件

背景：目前有关脐血间充质干细胞培养的实验较多,主要从改善培养基成分、脐血细胞的分离方法以及首次换液时间等方面进行调整,目前尚未建立一个安全、高效的培养体系。目的：探讨脐血间充质干细胞的适宜培养条件。方法：于新疆医科大学第一附属医院产科取健康产妇的脐血,比较不同换液时间、不同培养基、不同体积分数的胎牛血清对脐血间充质干细胞原代培养效果的影响。结果与结论：首次第5～7天换液、低糖DMEM、IMDM培养基有利于脐血间充质干细胞的生长。但还不能认为含体积分数为30%胎牛血清与含体积分数为20%胎牛血清的培养基在培养脐血间充质干细胞方面有差别。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景:目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/4,牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少.目的:观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定.结果与结论:脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖.流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变.     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析析☆

背景:目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法.目的:对传统的体外分离培养脐带血问充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-04/2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成.材料:取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意.方法:无菌条件下取新牛儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5～7 d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次.待细胞贴壁后,按处理方法不同分为2组:改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养:改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15%小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基.取第5代脐带血间充质干细胞,进行体外成骨及成脂诱导.主要观察指标:显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测绌胞诱导分化能力.结果:28份脐带血中20份培养出贴壁细胞(改良1组6份/10份,改良2组14份/18份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率为46.4%,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等问充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等呈阴性表达.在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论:脐带血中存在问充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率.     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导（含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L）,倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析

背景：目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法。目的：对传统的体外分离培养脐带血间充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-04／2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。材料：取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意。方法：无菌条件下取新生儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10％胎生血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5-7d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次。待细胞贴壁后,按处理方法不周分为2组：改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养;改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15％小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10％胎牛血清的α-MEM培养基。取第5代脐带血间充质干细胞,逍行体外成骨及成脂诱导。主要观察指标：显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测细胞诱导分化能力。结果：28份脐带血中20份培养出贴壁细胞（改良1组6份/10份,改良2组14份／18份）,其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞（改良1组4份,改良2组9份）,成功率为46.4％,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等间充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等早阴性表达。在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。结论：脐带血中存在间充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率。     

无血清培养脐带间充质干细胞的研究

本研究观察无血清培养液培养的人脐带间充质干细胞（UC-MSC）,并比较与含10％胎牛血清培养液培养的人脐带间充质干细胞的异同.采集正常足月剖宫产胎儿脐带,用MesenCult-XF无血清培养液或含10％胎牛血清培养液培养.观察不同培养液培养的间充质干细胞细胞的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用.结果表明,采用无血清MesenCult（R）-XF培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍,含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4,59±0.45倍（P＜0.05）;两种培养液培养的MSC均表达CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表达CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表达程度无明显统计学差异;无血清培养液培养的MSC（65±5.2）％均为G0/G1期细胞,含血清培养液培养的MSC（62±3.1）％为G0/G1期细胞（P＞0.05）;两种培养液培养的人脐带MSC均可向成脂细胞、成骨细胞分化;无血清培养液培养的脐带MSC按1 000、5 000、10 000、20 000个细胞/孔接种密度与反应细胞和刺激细胞共培养的每分钟闪烁值（CPM）分别为（6.43±0.47）×104、（4.30 ±0.38）×104、（1.97±0.13） ×104和（0.24±0.03）×104,含血清培养液培养的MSC与不同密度的混合淋巴细胞共培养的CPM值分别为（7.85 ±0.07） ×104、（5.64 ±0.12）×104、（3.09±0.18）×104和（1.73±0.05）×104.结论：无血清培养液培养的细胞均为MSC,有传代增殖潜能,传代可达临床治疗MSC细胞量,并可避免异种蛋白致敏.     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例（10%,20%,50%,80%,100%）的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

不同浓度重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖的影响

背景：重组人促红细胞生成素是一种糖蛋白,近年的研究表明其对神经细胞的许多功能活动均具有调节作用。目的：观察不同浓度重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖的影响。方法：提取新生SD大鼠神经干细胞,用含不同浓度（5,50,500U/mL）重组人促红细胞生成素和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行培养,以不含重组人促红细胞生成素无血清培养基为对照组。细胞培养7d后计算神经干细胞克隆形成率,培养10d后计数NSE和GFAP免疫阳性细胞数。结果与结论：添加重组人促红细胞生成素组细胞增殖较快,最终神经球的数量多于对照组,以50U/mL重组人促红细胞生成素组作用显著;50U/mL重组人促红细胞生成素组的生长速度显著快于对照组。50U/mL重组人促红细胞生成素组中NSE和GFAP免疫阳性细胞明显多于对照组（P〈0.01）。结果表明重组人促红细胞生成素对神经干细胞体外培养增殖有促进作用,尤以适中浓度（50U/mL）作用更加明显。     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景：脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法。目的：探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素。方法：分别从不同胎龄（≥40 周,37 周和≤32 周）,脐血中单个核细胞数量（≥2.5×109L-1,〈2.5×109 L-1）, 不同细胞接种浓度（1×107,1×109,1×1011 L-1）,不同体积分数胎牛血清（5%,10%,15%,20%）以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较。结果与结论：脐血间充质干细胞的分离培养成功率为 58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低（P〈0.01）;脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于〈2.5×109 L-1组（P〈0.01）;相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关（r=-0.95,P〈0.01）;1×1011 L-1 组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于 1×107,1×109 L-1;体积分数 5%FBS 组间充质干细胞贴壁速度较其他 3 组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他 3 组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组。提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响：通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系。     

不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性

目的：观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响，并优化培养条件与方法。 方法：实验于2006-02／2006—04在吉林医药学院临床检验实验室进行。①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态，即对数生长期。将细胞分成密度相同的4个组。离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜，其终浓度依次为5％、10％、15％、20％分装于冻存管。冻存15d后，每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养。培养12h后吸取少量实验细胞，加入等体积的0．1％台盼蓝染液，5min后在血球计数板上计数，被染成深蓝色的细胞为死细胞；染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞。每个标本计数500个细胞，计数2次取平均值，计算细胞的复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞，采用2种不同的方法进行复苏。第1组：立即将冻存管置37℃水浴中，待融化后1000r／min离心5min，吸去上清液，加入含10％小牛血清的RPMI～1640培养基，混匀后接种于细胞培养板继续培养。第2组：将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱，融化后离心、加培养基等操作同第1组。复苏细胞培养12h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备3×10^4／mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中，每孔1mL，然后分别加入5％、10％、12％、15％、20％的灭活小牛血清，每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12，24，36，48，60，72，84，96h后每种浓度各取1孔计数细胞量，绘制细胞生长曲线。 结果：①5％、15％、20％二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10％二甲基亚砜组比较，差异显著（86．70％，82．03％，63．09％，88．13％，P均〈0．01）。②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率。与40屯溶解后37℃恒温方法比较，差异非常显?     

人脐血间充质干细胞培养方法的比较

背景：脐血中含丰富的间充质干细胞,可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞,比较其生物学特性的差异。方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血,肝素抗凝。应用Ficol 密度梯度离心法分离脐血单核细胞,随机分为两组,其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养,20份用DMEM培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞,用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。结果与结论：MesenGro组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM组（P 〈0.01）。流式细胞仪检测显示,培养的细胞强表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105,阳性率99.1%,不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34,阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面,MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。     

脯氨酸羟化酶抑制剂可抑制小鼠骨髓间充质干细胞凋亡*☆

背景:脯氨酸羟化酶抑制剂能够通过稳定低氧诱导因子使其下游基因表达上调,进而对细胞凋亡发挥调控作用。目的:观察脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸对无血清培养引起的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:分离传代培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞。分别应用无血清(无血清对照组)及含体积分数10%胎牛血清(正常对照组)的DMEM培养基培养小鼠骨髓间充质干细胞24,48,72h,实验组在无血清对照组的基础上给予1mmol/L的二甲基乙二酰基甘氨酸。结果与结论:实验所获的细胞通过流式细胞仪细胞表型鉴定和三系分化鉴定证实为骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示,与无血清对照组比较,实验组骨髓间充质干细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。说明脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸可拮抗血清剥夺引起的骨髓间充质干细胞凋亡。     

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

背景：皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。目的：探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase过夜消化后去除表皮层结构,然后用0．1％I型胶原酶过夜消化,离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1％N2,2％B27,20μg／L表皮生长因子和40pg／L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM／F12（1：1）无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。结果与结论：RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirgl等特异基因的毛囊来源干细胞;免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6d时,可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的“铺路石”样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3,4时大部分细胞分化,不能继续传代。结果证实,以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。     

利用细胞外基质大规模扩增临床级人脂肪间充质干细胞

背景：如何运用无血清培养体系大规模扩增处于未分化状态的脂肪间充质干细胞,并使其保持“干性”是脂肪间充质干细胞临床应用转化中急待解决的难题。目的：建立含细胞外基质的脂肪间充质干细胞体外培养系统,验证其扩增细胞的高效性、有效性及安全性。方法：在无血清培养条件下,将体外分离得到的脂肪间充质干细胞分别接种在包被细胞外基质的培养板和传统二维塑料培养板上。经过体外扩增后,比较2种条件下细胞数量、细胞表面标记物表达、细胞衰老状况以及体外多向分化能力（诱导成脂、成骨和成软骨）的差异,考察脂肪间充质干细胞在含细胞外基质的培养条件下扩增后的临床安全性。结果与结论：脂肪间充质干细胞扩增到第5代时,包被细胞外基质培养板的细胞产量已经是传统二维塑料培养板的10倍以上,流式细胞检测表明,在含细胞外基质条件下扩增的脂肪间充质干细胞仍保持了干细胞表面特定标记物的表达。细胞衰老检测结果显示,使用包被细胞外基质的培养板扩增脂肪间充质干细胞至第15代时,细胞仍几乎无老化现象,而使用二维塑料培养板扩增的细胞在第5代时已出现明显老化,传代后细胞增殖能力明显下降。体外多向诱导分化实验显示,脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增至第15代时仍具有成脂、成骨和成软骨的分化功能,并且与第5代时没有明显差异,同时显著优于传统培养条件下的第5代脂肪间充质干细胞。染色体核型分析及小鼠成瘤性试验结果表明,脂肪间充质干细胞在含细胞外基质条件下扩增后仍具备临床应用的安全性。以上结果证实,含细胞外基质的无血清培养系统可以更高效且安全地扩增出具有临床应用潜能的脂肪间充质干细胞。     

纳米级二氧化锆增韧羟基磷灰石生物复合陶瓷对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

背景：课题组拟对纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石生物陶瓷进行一些初步研究,主要集中在生物力学匹配性,化学稳定性,以及生物相容性实验,其中体外细胞培养实验具有可控性,可重复性,能很好地反映材料的生物相容性。目的：比较纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石两种材料对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法：将骨髓基质干细胞置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠,地塞米松和维生素C的条件培养基培养。取传至第3代的成骨细胞,以1.0×108L-1浓度接种于放有材料块的细胞培养板中,培养第1~10天倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,并进行碱性磷酸酶活性检测。培养第6天的细胞和材料复合物用多聚甲醛固定进行扫描电镜观察。结果与结论：MTT法测得两种材料培养的细胞生长曲线无显著差异。复合培养的兔骨髓基质干细胞能够保持正常分泌碱性磷酸酶的功能。电镜照片也同样证实了两种材料表面均有细胞的附着。说明纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石均不影响成骨细胞增长分化,具有优良的成骨细胞相容性。