日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选

目的：从日本血吸虫虫卵文库中筛选并鉴定出与免疫诊断及免疫预防有关的基因克隆。方法：采用Ｓ．ｊＳＥＡ超免疫兔血清对日本血吸虫卵文库进行筛选。先去除抗大肠杆菌抗体，经三轮筛选得到１２个阳性克隆，然后，用辅助噬菌体进行体内剪切，经抗菌素平板筛选含重组质粒的阳性菌落，每个菌落分为２份，一份进行ＰＣＲ扩增以测定插入片段的大小。另一份用于制备纯质粒ＤＮＡ模板，进行ＤＮＡ序列测定，通过ＧＣＧ软件对所得ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列进行同源性比较。结果：共筛得１２个阳性克隆，ＰＣＲ后测得其长度大多为１．２ｋｂ，其中８个与Ｓ．ｊ热休克蛋白７０的基因同源，２个与Ｓ．ｊ钙网蛋白同源，１个与Ｓ．ｍｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ同源，１个与Ｓ．ｊ２３ｋＤａ蛋白同源。结论：本研究首次报道用抗ＳＥＡ血清对日本血吸虫虫卵文库的筛选结果，所得的１２个阳性克隆均为编码日本血吸虫免疫诊断及预防有关的基因。     

日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库的免疫筛选及PCR初步鉴定

用成虫抗原免疫免血清筛选构建于表达载体λgt11的日本血吸虫成虫cDNA文库，再以多聚酶链反应（PCR）技术鉴定免疫筛选的阳性克隆。结果，对cDNA表达库中随机选取的约6.2×104个噬菌斑进行了筛选．初筛时共挑出52个可能的阳性斑，经两次复筛后，有25个噬菌仍呈阳性反应；以阳性噬菌斑DNA为模板，经PCR扩增均可获得一定大小的片段，从564bp到1200bp不等。这样能快速大量地筛选cDNA文库，便于高效地获得有价值的重组抗原基因克隆。     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的　筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。　方法　用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清 ,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增 ,采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序 ,与GeneBank中的已知序列进行比对分析。　结果　共获得 2 6个阳性克隆 ,其PCR产物大小约 0 .5～ 3kb。在进行测序的 8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列 (GeneBank登录号为AY3 2 2 14 8)和 1个新基因 (命名为Sj F1,GeneBank登录号为AY2 61995 )。Sj F1编码的蛋白理论分子质量为 13 .45ku ,等电点为 6.2 9,富含α螺旋和随机卷曲 ,含多个蛋白激酶磷酸化位点 ,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个豆蔻酸位点。　结论　Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子 ,该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值 ,有待进一步研究。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

日本血吸虫(中国大陆株)虫卵cDNA文库的构建

应用定向克隆方法，将日本血吸虫虫卵ｃＤＮＡ片段重组入噬菌体载体λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ的ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切位点之间。所构建的基因表达文库的容量为１．０７×１０７重组子。经含有ＩＰＴＧ及Ｘ－Ｇａｌ的颜色选择平皿测定，初步提示重组效率达１００％。     

用特异性抗体筛选日本血吸虫基因组DNA基因库

用酶免疫测定法筛选日本血吸虫(S.j.)基因组DNA基因库,先将λ噬菌体(λgt11),重组体噬菌斑的表达抗原转移至硝酸纤维(NC)膜,然后用经导入λgt11的大肠杆菌Y1090细胞裂解液吸收的感染兔血清(IRS)检测。结果,从97只平板初筛出8个可能阳性噬菌斑,经再次筛选,8个中2个仍为阳性。其中1个阳性克隆经纯化后导入Y1089细胞扩增,其表达产物经ELISA复筛进一步证实S.j.抗原阳性。表明该克隆编码S.j.抗原,该克隆的表达产物能被IRS识别。该免疫筛选方法能有效地分离单个编码S.j.抗原的克隆,且筛选效率高(每次可筛选1×10~5噬菌斑形成单位),结果可靠、特异,不需要同位素标记技术,操作简便,为进一步筛选编码诱导S.j.保护性免疫力的抗原的基因打下基础。     

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的构建及分析

目的　构建日本血吸虫尾蚴 c DNA文库。　方法　从日本血吸虫尾蚴中提取总 RNA,运用“SMART c D-NA文库构建试剂盒”构建文库。　结果　所建文库的初始滴度为 1.8× 10 7pfu/ ml,经 1次扩增后的滴度为 2 .5× 10 7pfu/ ml,插入子的平均长度为 1.0 75 kb,重组率为 94 .4 % ,并从该文库中调出了日本血吸虫保守基因 TPI和 JF2的全长 c DNA片段。　结论　构建了日本血吸虫尾蚴 c DNA文库     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫成虫cDNA库的构建、免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

作者构建了一个日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达库,该库的大小含有5×10~5重组体。采用慢性感染血吸虫病人混合血清对重组空斑进行免疫学筛选,已初筛出9个阳性斑,其中8个克隆的溶源表达产物,经SDS-PAGE表明,有2个克隆各表达了分子量大于116kD的融合蛋白,在Western blot分析中均被血吸虫病人血清所识别。     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

日本血吸虫模拟虫卵抗原表位的筛选和鉴定

目的　通过噬菌体肽文库技术探索可用于诊断日本血吸虫病的模拟虫卵抗原。　方法　用日本血吸虫虫卵单克隆抗体 6 B12作“诱饵”,采用生物淘金法从噬菌体 15 -肽文库中经过 3轮筛选 ,有效地富集与 6 B12有亲和力的噬菌体肽克隆。随后采用 EL ISA、竞争 EL ISA、Western blotting等检测方法 ,从 4 0 0个单克隆化的噬菌体株中得到 13株与 6 B12有特异性、高亲和力反应的噬菌体克隆。　结果　对噬菌体所携带的外源 DNA片段序列测序结果表明 ,13株噬菌体所携带的外源多肽序列完全相同。该噬菌体多肽抗原包被酶标板经 EL ISA方法对血吸虫病患者及健康人血清Ig G抗体检测结果表明 ,两者有显著性差异。　结论　噬菌体多肽模拟抗原有可能替代天然抗原用于血吸虫病诊断     

日本血吸虫未成熟卵抗血清对日本血吸虫cDNA文库的免疫筛选

目的为了获得抗雌虫生殖和卵胚发育相关抗原的血吸虫基因。方法通过采用抗日本血吸虫未成熟卵SIEA26—28kDa免疫血清对日本血吸虫成虫cDNA文库进行筛选。结果共获得阳性克隆23个,经重复筛选之后,随机挑取其中的5个阳性克隆,分别进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示获得单一扩增条带,其大小位于150bp～1.5kb之间。结论从SjcDNA文库中筛选出抗卵相关阳性克隆,有关分析鉴定在进一步进行中。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的　为弓形虫疫苗研制提供新的候选分子。　方法　用弓形虫免疫兔血清作为探针筛选弓形虫速殖子cD NA文库 ,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。　结果　筛选出 6个阳性克隆 ,其插入片段大小约为 45 0～ 2 0 0 0bp ,随机选取Toxo D2、Toxo D3、Toxo D5三个阳性克隆进行测序 ,将所得的序列与GenBank进行对比分析 ,发现Toxo D3与狒狒的线粒体DNA同源 ,Toxo D5与弓形虫致密颗粒蛋白 1序列同源 ,而Toxo D2为一新基因 (GenBank登录号为AY2 2 3 5 3 8) ,编码 3 68个氨基酸 ,有完整阅读框 ,PROSCAN分析显示该新基因含有 1个N 糖基化位点 ,9个蛋白激酶C磷酸化位点 ,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点 ,7个肉豆蔻酰化位点。　结论　新基因的获得为弓形虫病疫苗和免疫诊断的进一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫虫卵的二维数据测量

目的　设计人门静脉内日本血吸虫虫卵过滤器孔眼的大小。方法　采用图像分析仪测量虫卵的周长、面积、长径、短径、等效直径、圆球度。依据长径、短径数据算出虫卵的体积和均值。结果　长径最大值84.55μm,最小值39.19μm;短径最大值57.22μm,最小值23.2μm。体积最大值131 039μm     

日本血吸虫cDNA文库中抗卵分子克隆的免疫筛选及鉴定

本文采用具有明显抗卵胚发育和抗雌虫生殖双重作用的免疫血清对SjcDNA文库进行免疫筛选，共鉴定阳性克隆102个，进一步复筛后对其中6个克隆以自动DNA测序仪对。DNA插入子测序，测序资料经基因数据库GCG软件处理。表明C40克隆类似于Sm铁蛋白基因，C31克隆类似于N.forntalis的PEPCK酶基因．C21为Sj热休克蛋白70基因，C29为副肌球蛋白基因，C30和C35克隆分别为印壳蛋白基因和钙网硬蛋白基因·上述6个基因克隆的同源程度分别为74．7％、57．1％、80．1％、86．4％、96．4％和80．6％。