表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究

目的探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性。方法（1）用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率。（2）将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果。（3）取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组：A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照。观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间。结果体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组（P〈0．05）。移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短（P〈0．05或P〈0．01）。结论以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗。     

应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤及移植实验

目的探讨应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤修复全层缺损皮肤的可行性。方法选择新西兰大白兔18只,在每只兔背上用常规手术方法切去3个大小相同的全层皮肤缺损创面,面积约2cm×2cm。将经处理的脱细胞真皮（acellular dermal matrix,ADM）接种骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）和表皮千细胞（epidermal stem cells,ESCs）制成复合皮肤。实验分A、B、C3组,A组移植复合皮肤;B组移植脱细胞真皮;C组用油纱布敷盖创面。观察各组移植后1～3周内创面愈合、肉芽组织生长及上皮化等情况,并进行创面组织HE染色。结果术后A、B、C3组创面愈合时间分别为（14．6±1．1）、（18．3±1．2）、（23．0±1．4）d,组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。术后14d创面标本HE染色观察：A组创面已上皮化,毛细血管、成纤维细胞数量增加,胶原合成增多,肉芽组织形成丰富;B、C组创面上皮化不全,仍可见许多炎性细胞,肉芽组织中毛细血管、成纤维细胞数量不如A组。结论表皮干细胞、间充质干细胞接种于脱细胞真皮构建复合皮肤,可加速新生血管形成及创面上皮化,可用于全层皮肤缺损创面的治疗,提高创面愈合质量。     

糖尿病模型皮肤创面中人真皮多能干细胞向表皮细胞的分化

背景：研究表明,干细胞分化为何种细胞与其所处的微环境密切相关。因此设想：人真皮多能干细胞处于皮肤创面的微环境中,可能具有向人皮肤细胞转化的潜能。目的：探讨糖尿病皮肤创面微环境中的人真皮多能干细胞分化为表皮细胞的可能性。方法：分离培养人真皮多能干细胞并制作糖尿病裸鼠模型皮肤创面,将标记5-BrdU的第3~5代人真皮多能干细胞以注射方式回植入糖尿病裸鼠创面组织周围,分别于注射后2,3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。结果与结论：BrdU阳性细胞出现在表皮中,且连续切片中部分BrdU阳性细胞也同时表达角蛋白。说明在糖尿病创面愈合过程中,人真皮多能干细胞具有向表皮细胞分化的潜能。     

糖尿病模型皮肤创面中人真皮多能干细胞向表皮细胞的分化

背景:研究表明,干细胞分化为何种细胞与其所处的微环境密切相关.因此设想:人真皮多能干细胞处于皮肤创面的微环境中,可能具有向人皮肤细胞转化的潜能.目的:探讨糖尿病皮肤创面微环境中的人真皮多能干细胞分化为表皮细胞的可能性.方法:分离培养人真皮多能干细胞并制作糖尿病裸鼠模型皮肤创面,将标记5-BrdU的第3~5代人真皮多能干细胞以注射方式回植入糖尿病裸鼠创面组织周围,分别于注射后2,3周取材,常规石蜡包埋、连续切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色.结果与结论:BrdU阳性细胞出现在表皮中,且连续切片中部分BrdU阳性细胞也同时表达角蛋白.说明在糖尿病创面愈合过程中,人真皮多能干细胞具有向表皮细胞分化的潜能.     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的:观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性,评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。方法:实验于2004-09/2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7～25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组,首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1,将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数;对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察;并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5d铺满培养瓶底,而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[(119.0±3.0),(246.3±19.6),(241.3±15.3),(262.0±11.1)个/100倍视野,P≤0.01];对照2组与各实验组差异无显著性意义(P>0.05)。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。结论:表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性,回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响,并可节约费用。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的:通过表皮干细胞对基底膜的黏附性,利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质,探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法:取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤,通过酶消化法获得幼鼠表皮,并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物,利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果:与角质细胞对照,表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好,克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色;广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论:用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0mm×5.0mm皮条片,4℃胰蛋白酶 EDTA联合消化8~10h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,20min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液,细胞约70%~80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强;1d后细胞略伸展为扁平的多角形,胞质近中央处有圆形核;3d时出现表皮干细胞克隆;5d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状;14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P<0.05)。结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的：通过表皮干细胞对基底膜的黏附性，利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质，探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法：取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤，通过酶消化法获得幼鼠表皮，并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物，利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果：与角质细胞对照，表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好，克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色；广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论：用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

骨髓间充质干细胞在糖尿病创面中向皮肤腺上皮的分化

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,目前已证实其在急性创面中能够向皮肤组织细胞转化,但在糖尿病创面中的分化报道甚少.目的:观察糖尿病创面皮肤微环境中的骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的可行性.方法:全骨髓法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第三四代细胞行5-BrdU标记.采用一次性腹腔注射链脲佐菌素法建立糖尿病大鼠模型,2周后在模型鼠背部制作圆形创面,取密度为1×10~9 L~(-1) 5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL注射于创面边缘,分别于细胞移植后2,3周切取创面中央再生组织制备切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色.结果与结论:BrdU阳性细胞出现在表皮、真皮及皮下组织各层,部分阳性细胞位于皮脂腺及腺导管上皮中;连续切片中BrdU阳性细胞同时也表达角蛋白,以腺导管上皮多见.提示在糖尿病溃疡创面愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向皮肤附属器细胞分化的潜能.     

组织工程皮肤移植过程中白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达

背景:白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在异体异种皮肤移植局部免疫与排斥反应中发挥了重要作用.但在组织工程人工皮肤移植过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达情况目前尚不清楚.目的:采用表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤并移植修复兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果和局部皮肤组织白介素10与肿瘤坏死因子α的表达变化.方法:将体外培养的人表皮干细胞或角质细胞接种到脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤;取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面随机分为4组,表皮干细胞组、角质细胞组用含表皮干细胞或角质细胞的组织工程皮肤移植于皮肤缺损创面;脱细胞真皮组移植单纯脱细胞真皮;对照组创面空置.观察刨面修复情况,局部炎症反应,创面愈合时间.各组分别于术后7d在部分创而取材观察组织形态和白细胞介素10与肿瘤坏死因子α表达.结果与结论:含表皮干细胞的人工皮肤移植后创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较角质细胞组明显缩短.白细胞介素10在各组均有表达,其中表皮干细胞组表达最强,角质细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组最弱.肿瘤坏死因子α在各组也均有表达,其中角质细胞组表达最强,表皮干细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组较弱.说明以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用有效促进皮肤缺损创面的修复治疗,创面修复过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子的表达变化可能是其取得较好效果的主要机制之一.