人诱导性多能干细胞及分化产物在发育毒性研究中的应用

个体成年之前因接触外源化学物质而产生的任何有害影响均会造成自身生长发育异常,因此,药物开发乃至临床运用均需要可靠的发育毒性实验数据来证明其可用性.人诱导性多能干细胞(hiPSCs)作为一种新型的体外细胞来源,其生理特点与胚胎干细胞类似,具有无限增殖和多向分化的潜能.近年来,不断有研究检测了外源物对hiPSCs及其衍生的...     

CsgRNA减少APOBECs在Cas9-D10A介导的基因编辑过程中引入的突变

目的：通过csgRNA策略降低APOBECs蛋白对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变。方法：针对Cas9-D10A/sgRNA4 和Cas9-D10A/sgFANCF打靶位点的非切割链设计csgRNA并对csgRNA的碱基长度和空间结合位置进行精细优化,在293FT-APOBEC3B过表达细胞系检测基因突变效率。结果：与对照组比,在sgRNA4和sgFANCF打靶位点上,csgRNA明显降低Cas9-D10A进行基因编辑时产生的切割条带;通过对csgRNA条件优化,发现当csgRNA长度为16 bp且作用位置向PAM端延伸2个碱基或csgRNA长度为20 bp且作用位置向PAM端延伸4个碱基时,其降低APOBEC-3B对Cas9-D10A/sgRNA产生的突变效果较好。结论：CsgRNA策略成功降低了APOBEC-3B对Cas9-D10A/sgRNA系统进行基因编辑时产生的突变。     

成年狨猴肾脏细胞体外培养体系的建立及CRISPR/Cas9基因编辑的应用

目的建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA切割活性的体系。方法取成年的狨猴肾脏,采用贴壁法、消化法得到狨猴肾脏细胞。对细胞进行生长曲线测定、转染试剂(Viafect和Lipo2000)及抗性(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)浓度筛选,将SIRT1的sgRNA质粒和Cas9质粒共转染狨猴细胞,提取基因组并对基因修饰目的片段扩增,并将扩增产物进行测序。结果建立狨猴肾脏细胞体外培养体系;ViaFect转染试剂转染率大于60%;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4μg/mL,杀稻瘟菌素8μg/mL;测序结果表明,从sgRNA的PAM序列附近开始出现突变峰,证明sgRNA成功引入突变。结论成功建立了狨猴肾脏细胞的体外培养、细胞转染和抗性筛选体系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴肾脏细胞编辑,为基因修饰狨猴靶点选择提供依据。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术生成靶向识别Her2的B细胞免疫治疗研究

目的 利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法 设计针对B细胞抗原受体（BCR）的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率。通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板。分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒（IDLV）,用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑。将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖。用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞。从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力。结果 选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA（约为52%）作为最终的打靶序列...     

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的 建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法 根据人GPR108基因序列设计，合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列，构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP⁺细胞于96孔培养板中，培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108^-/-和GPR108^+/+的THP-1细胞，Western blot法检...     

经尿道双极等离子电切前列腺的临床应用

目的 评价经尿道双极等离子体前列腺切除(TUPKVP)的安全性和有效性.方法 选择87例良性前列腺增生(BPH)患者,年龄(71.6±15.6)岁.采用等离子体切割技术行经尿道前列腺切除,切割方法采用Alcoek或Flocks法,术后随访3个月～1年,比较术后最大尿流率(Qmax)和国际前列腺症状评分(IPSS)情况.结果 手术时间50-120min,切割获取前列腺组织平均50g,平均出血100mL,术后持续膀胱冲洗时间1-2d,留置导尿管时间3～5d,平均住院时间8d;术后3个月Qmax平均恢复至每秒24.5mL,IPSS评分自平均24分降至6分.结论 初步显示TUPKP治疗前列腺增生症是安全可靠的,与经尿道前列腺电切术(TURP)比较,安全性更高,适应证广.出血少、损伤小,恢复快.     

血管内超声、切割球囊和非顺应性球囊在支架内再狭窄中的应用

目的应用血管内超声(IVUS)探讨支架内再狭窄的机制，研究切割球囊及非顺应性高压球囊治疗支架内再狭窄的近远期疗效。方法48例患者，56支病变冠脉，64处病变，血管内超声检测显示内膜增生为主者48处予切割球囊扩张，显示为原支架扩张不充分伴内膜增生者16处予非顺应性高压球囊扩张，术后平均5.3月行冠脉造影随访。结果血管内超声显示内膜增生为支架内再狭窄的主要因素的患者(66.7％)采用切割球囊扩张，扩张前后支架内增生内膜的面积缩小(P＜0.05)，支架截面积变化不大(P＞0.05)；血管内超声显示原支架扩张不充分伴内膜增生的患者则予非顺应性高压球囊扩张，扩张前后支架截面积增加(P＜0.05)；同时支架内增生内膜面积减小(P＜0.05)。冠脉造影随访，切割球囊组和非顺应性球囊组再次支架内狭窄发生率分别为28.6％、29.7％(P＞0.05)。结论结合应用血管内超声，切割球囊和非顺应性球囊可以在支架内再狭窄的治疗中取得更佳疗效，值得推广应用。     

人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞

目的: 探索人源诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）在体外二维条件下诱导分化生成肝细胞的条件,并初步探讨三维条件下 hiPSCs 的肝细胞诱导分化。方法: 通过测定4种诱导培养基中白蛋白和甲胎蛋白含量,筛选诱导分化的最佳方案。用筛选出的最优培养基对hiPSCs进行二维培养,采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测诱导后的细胞中肝脏标志蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法检测肝细胞功能相关蛋白的含量;对hiPSCs进行三维培养,用酶联免疫吸附法对比二维与三维条件下肝细胞功能,并用 HE 染色法观察三维条件下形成细胞的形态。结果： 二维条件下诱导分化23 d,倒置显微镜下细胞呈典型的肝细胞形态;免疫荧光法、蛋白质印迹法检测到诱导分化后的细胞阳性表达肝脏特征蛋白（甲胎蛋白、白蛋白、角蛋白CK8、角蛋白CK18、SOX17）,且与胚胎干细胞来源肝细胞（hESCs HEPs）内含量相近;酶联免疫吸附法测定结果显示,诱导形成的肝细胞具有正常肝细胞功能,表明hiPSCs已分化为肝细胞;HE染色结果显示三维条件下诱导形成的细胞具有明显双核,呈现典型肝细胞形态;酶联免疫法测定结果显示,三维条件下,诱导形成的肝细胞功能没有受到损伤,仍具有正常肝细胞功能。 结论： 在二维与三维培养体系下,采用最佳诱导分化方案,hiPSCs 能够被诱导分化为肝细胞,且表达肝脏相关蛋白,并具有正常肝细胞功能。     

经尿道双极等离子治疗高危前列腺增生症

目的探讨经尿道双极等离子治疗高危前列腺增生症(BPH)的安全性与可靠性.方法应用双极等离子切割系统,采用分叶推移切割法对35例高危BPH行经尿道前列腺双极等离子切除(PKRP).结果35例高危BPH均安全切除,术后排尿通畅,无尿失禁.结论经尿道前列腺双极等离子切除(PKRP)治疗高危BPH安全可靠;采用分叶推移切割可提高腺体组织的切除率.     

微创玻璃体切割联合内界膜剥除术治疗黄斑裂孔的疗效及安全性分析

目的:探究微创玻璃体切割术联合内界膜剥除术(ILMP)对黄斑裂孔(MH)的治疗有效性及安全性.方法:选取2017年12月—2020年8月我院收治的70例MH患者(共70眼)进行回顾性分析,依据治疗方案的不同分为对照组和观察组,每组35例(35眼).对照组采用25G微创玻璃体切割术进行治疗,观察组采用25G微创玻璃体切割...     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

ERBE T71D高频电刀功放电路故障维修

ERBE T71D高频电刀可以提供最大50W的输出功率,广泛应用于各手术科室.其电路主要由以下几部分组成:(1)电源电路;(2)高频振荡电路;(3)功率放大电路;(4)电切、电凝选择及功率调节电路;(5)显示及报警电路.由于采用了500kHz以上的高频电路,从而充分发挥了高频电流与肌体接触时产生的热效应的作用,实现切割和凝血功能,而避免了法拉第效应和电解效应的产生.     

时空关联成像技术在正常胎儿心脏超声检查中的应用

目的 探讨时空关联成像(STIC)技术在正常胎儿心脏超声检查中的操作方法 与应用价值.方法 110例 中晚孕期正常胎儿,经常规超声筛查心脏未见异常.采用STIC技术一次性扫描获得胎儿心脏整体容积数据,存盘后进行脱机分析:(1) 采用超声断层显像(TUI)模式,通过调节层距和中心层位置,分别显示四腔心,左心室流出道、右心室流出道和三血管切面动态图像,并采用评分方法 比较TUI图像与二维超声直接获得的各切面图像质量差异.(2)采用动态正交三平面(MP)模式,通过调节切割面和正交点位置,在A、B、C 3个相互垂直的平面上显示心脏节段性分析中所需要的10余个标准切面,分析主要结构的静态与动态图像.结果 110例胎儿心脏均获得满意的容积图像.平均每次STIC扫描时间为(55±15)s.TUI模式下可重现胎儿心脏超声筛查所需的4个标准切面,各切面图像的显示合格率与二维扫描图像差异无显著性(P>0.05).选取39例扫描起始切面为心尖四腔心切面的样本在MP模式下进行了心脏节段性分析,在心房、心室和大动脉3个节段的显示中,除房室瓣口短轴的显示合格率较低(41%)外,主要解剖结构的显示合格率在72%～100%.在心室节段中,均可显示室间隔的完整剖面.结论 实时三维超声成像可简化胎儿心脏图像采集的过程,减少对操作经验的依赖和对胎儿心脏的超声照射时间.     

2μm激光与等离子双极气化术治疗良性前列腺增生症的疗效比较

随机采用2μm激光汽化切割术与等离子双极气化术(PKRP)治疗良性前列腺增生症(BPH)患者37例、85例,术后症状较术前均明显改善,但激光汽化切割术治疗BPH的近期疗效优于PKRP.因此认为可根据患者情况选择不同方法,以获得更好的临床效果.     

鼠原始生殖细胞报告基因系统的建立及验证

目的:构建小鼠原始生殖细胞（PGCs）报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞（ESCs）中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs（mouse ESCs）定向分化为mPGCs（mouse PGCs）,流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠

目的探讨应用CRISPR/Cas9技术制备敲除雄激素受体(AR)和胰岛素受体底物2(IRS2)基因大鼠,构建可用于研究的稳定遗传的基因敲除大鼠品系。方法针对与雄激素表达相关基因-AR基因和胰岛素表达有关的胰岛素受体底物(IRS)基因设计出了20 bp的AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,设计出的sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,F0代大鼠出生后取其基因组DNA测序鉴定基因型后,对确认敲除的大鼠F0与野生型交配,获得杂合子F1代。结果设计了20 bp AR/IRS2 sgRNA和30 bp AR/IRS2 sgRNA,与Cas9一起进行了体外转录后显微注射至SD大鼠受精卵细胞,共获得2个受精卵并移植到1只雌性代孕大鼠。繁殖出嵌合体大鼠F0 2只(#51,#56),F0#51、#56与野生型大鼠合笼,繁殖出F1大鼠9只,其中F0#51繁殖出3只为双敲大鼠(#12,#13,#18),其余6只为单敲大鼠,F0#51产生的3只双敲大鼠发生不同程度的碱基插入或缺失,其中#12,#18大鼠在AR基因上缺失7个碱基(CCCCGGC),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。#13大鼠在AR基因上插入2个碱基(CG),在IRS2基因上缺失4个碱基(GCGC)。大鼠的AR、IRS2基因表达被破坏。结论采用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除基因AR、IRS2大鼠,经基因测序和蛋白质免疫印迹鉴定AR、IRS2,证明正确,为下一步鉴定是否表现出多囊卵巢综合征表型特征打下基础。     

基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81...     

切割缝合器在肺切除术中的应用

目的 分析肺切除术运用切割缝合器术后支气管胸膜瘘的发生情况,以评价切割缝合器闭合支气管残端的效果.方法 回顾性分析2004年12月至2008年12月笔者所在医院269例次行肺切除术支气管残端闭合方法,应用切割缝合器共227例,占84.4%,其中137例为胸腔镜辅助下小切口采用内镜切割缝合器,占60.4%,90例为标准后外侧切口采用直线切割缝合器,占39.6%.结果 术后共发生5例支气管胸膜瘘(总发生率为1.9%):其中1例采用传统缝线缝合(占2.4%),4例采用缝合器缝合(占1.8%),两种方法无明显统计学差异.上述5例支气管胸膜瘘患者中有2例死于相关并发症.结论 虽然用缝合器闭合支气管残端仍存在手术失败,但其发生率可以接受,并且该方法并未直接导致术后支气管胸膜瘘.内镜切割缝合器与直线切割缝合器在术后支气管胸膜瘘的发生率上没有统计学差异,说明内镜切割缝合器可以广泛用于支气管残端的闭合.此外,采用缝合器可以减少手术术野的污染,将切割和缝合两种手术操作合二为一节约了手术时间.     

吊顶灯广角镜下25 G微创玻璃体切割术治疗复杂增生性糖尿病视网膜病变疗效分析

目的:分析吊顶灯广角镜下25G微创玻璃体切割术治疗复杂增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的效果.方法:选取我院2019年2月—2020年2月收治的PDR患者94例,按照随机数字表法分为25G组和20G组,各47例.25G组采用25G微创玻璃体切割术,20G组采用20G微创玻璃体切割术.比较两组手术时间、住院时间,术前与术...     

构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究

目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究.方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2A-TetR 片段.通过同源重...