以葡萄糖调节蛋白78（GRP78）为靶向的胰蛋白酶抑制剂抗肠癌效应研究

 目的  构建以肿瘤细胞表面葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)为靶向的重组绿豆胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor,TI)活性片段GBP-TI,并探讨其抗肠癌的分子靶向效应。方法  用带有GRP78结合肽(GRP78 binding peptide,GBP)表达序列的引物PCR扩增胰蛋白酶抑制剂活性片段,构建GBP-TI的原核表达载体;采用GST亲和层析柱纯化获得GBP-TI蛋白;激光共聚焦方法检测GBP-TI与GRP78的相互作用;MTT和DAPI细胞核染色方法分别检测GBP-TI对大肠癌细胞存活和凋亡的影响。结果 GBP-TI能够与大肠癌细胞表面的GRP78相互作用;与GST-TI相比,GBP-TI能够剂量依赖性地诱导大肠癌细胞死亡,而对正常细胞生长无明显影响。结论 GBP-TI可以通过结合肿瘤细胞表面GRP78蛋白特异性杀伤肿瘤细胞。本研究为肿瘤靶向治疗提供了一种新的策略。     

葡萄糖调节蛋白94在结肠腺癌中的表达及其意义

目的探讨结肠腺癌组织中葡萄糖调节蛋白94(GRP94)的表达及其与结肠腺癌分化程度、临床分期及转移等的关系。方法采用免疫组织化学S-P法分别检测结肠腺癌组织、结肠腺瘤组织及正常结肠组织GRP94表达情况,结合临床病理特征光学显微镜下用半定量方法对结果进行统计分析。结果正常组织、腺瘤组织及腺癌组织中均有GRP94表达,其表达程度呈递增趋势。其表达程度随着细胞分化的降低、临床分期的增加及肿瘤转移而增高,与患者性别、年龄无关。结论GRP94的高表达可能参与结肠癌的发生、发展,对结肠癌肿瘤细胞有保护作用,抑制GRP94的表达有可能抑制肿瘤生长。     

特异性下调GRP78基因表达对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默葡萄糖调节蛋白78（GRP78）基因对人卵巢癌细胞耐药性的影响,阐明GRP78基因沉默逆转肿瘤细胞耐药性的生物学机制。方法：构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3/DDP细胞;RT-PCR和Western blotting法检测GRP78基因的蛋白的表达;Western blotting法检测caspase-4和caspase-3蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：转染GRP78 siRNA重组质粒的SKOV3/DDP细胞GRP78基因和蛋白表达较转染空质粒组明显降低(P<0.05);加用顺铂后,转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组较未转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组caspase-4和caspase-3表达明显增加(P<0.05),细胞凋亡率也明显增加(P<0.05)。结论：抑制GRP78基因表达能通过上调caspase-4和caspase-3表达及增加顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞凋亡率,降低SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作佑

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞(231)侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体，转染入231细胞，利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况；并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞；反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因，下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

GRP78蛋白在胃癌中的表达及作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在胃癌中的表达及作用。方法收集不同临床分期和分化程度的胃癌标本48例,癌旁正常胃黏膜组织28例。运用免疫组织化学技术检测胃癌及其转移癌组织中GRP78蛋白的表达;采用MTT及Transwell观察GRP78蛋白对SGC-7901胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果免疫组织化学结合临床病理分析结果显示:GRP78蛋白位于胞质,且在胃癌组织中GRP78蛋白较正常胃黏膜组织明显增加,其阳性表达率与胃癌的直径、分化、淋巴结转移、分期、复发有关(P＜0.05)。MTT及Transwell结果显示:干扰GRP78蛋白表达可抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖和迁移能力。结论GRP78蛋白在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期及预后有关。     

葡萄糖调节蛋白78和基质金属蛋白酶在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)和基质金属蛋白酶(MMPs)在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义,阐明GRP78在口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用.方法 采用免疫组织化学方法检测26例口腔鳞状细胞癌组织和10例正常口腔组织中GRP78蛋白的表达;采用逆转录PCR检测正常口腔组织和口腔鳞状细胞癌组织中GRP78 mRNA的表达;采用免疫组织化学方法检测26例口腔鳞状细胞癌组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达.结果 GRP78蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为100％(26/26),在正常口腔组织中的阳性表达率为20％(2/10),两者比较差异有统计学意义(P＜0.01);与高分化和中分化口腔鳞状细胞癌组织比较,低分化口腔鳞状细胞癌组织中的GRP78蛋白阳性表达强度明显增高(P＜0.05).与正常口腔组织比较,GRP78 mRNA表达水平在口腔鳞状细胞癌组织中的表达增高(P＜0.05).MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率均为100％(26/26).结论 GRP78和MMPs在口腔鳞状细胞癌组织中表达明显升高,提示口腔鳞状细胞癌中GRP78蛋白的表达可能与肿瘤的侵袭和转移相关.     

短发夹状RNA对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用

目的探讨短发夹状RNA对糖调节蛋白78(GRP78)在结直肠癌RKO细胞中表达抑制作用。方法以脂质体Lipofectamine2000介导GRP78短发卡状RNA(shRNA-GRP78)质粒表达载体转染RKO细胞,G418筛选得到稳定表达株,半定量RT-PCR和Westernblooting方法检测GRP78mRNA和蛋白水平变化。结果转染成功并筛选出稳定表达RKO细胞株。与对照组相比,shRNA-GRP78转染RKO细胞GRP78的mRNA及蛋白水平均显著下降(t=7.079、7.510,P<0.05)。结论 shRNA-GRP78能明显抑制RKO细胞GRP78mRNA及蛋白的表达,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记的GRP78蛋白表达和功能研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)来标记葡萄糖调节蛋白78(GRP78),从而研究其与免疫细胞结合的情况。方法:通过在原核表达的GRP78的C末端连接一个EGFP来显示跟踪该蛋白的表达,进而通过流式细胞仪检测该蛋白同小鼠脾脏免疫细胞结合的情况。结果:GRP-EGFP融合蛋白分子量为126kD,Western Blot证实该蛋白表达正确,并且表达GRP78-EGFP的BL21菌在紫外光激发下发射出强烈的绿色荧光;与EGFP单体相比较,GRP78-EGFP主要与中性粒细胞相结合,其平均结合率为5.15%。结论:绿色荧光蛋白标记的GRP78蛋白在原核中的表达具有天然构象并能发挥标记目的蛋白的作用。     

葡萄糖调节蛋白78在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDCA）中葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78,GRP78）的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学技术分析30例胰腺癌组织和对应的癌旁组织中GRP78蛋白的表达水平,并分析GRP78的表达与患者临床病理资料的关系。结果免疫组化结果显示GRP78在癌组织中表达明显高于癌旁组织（73．3％ vs 23．3％,P〈0．05）。单因素分析发现GRP78高表达的患者预后较差（P=0．009）。Western blot显示GRP78在中低分化癌细胞中的表达明显高于高分化癌细胞（P〈0．05）。结论GRP78在胰腺癌组织中高表达,可能参与胰腺癌的发生发展,GRP78高表达可能有助于判断胰腺癌患者的预后。     

GRP78基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因短发夹RNA表达载体并鉴定,为探讨GRP78对胃癌发生发展作用及机制提供前期基础。方法运用核糖核酸(RNA)干扰技术构建靶向干扰GRP78蛋白短发夹RNA(GRP78-shRNA)载体,载体经转化、抽提及测序,用脂质体将GRP78-shRNA载体瞬时转染至SGC-7901胃癌细胞中,应用荧光显微镜、反转录定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)观察GRP78表达情况。结果GRP78-shRNA载体测序显示序列正确;转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞可见绿色荧光;qRT-PCR和Western blot结果显示,转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞中GRP78基因和蛋白表达降低。结论成功构建并鉴定GRP78基因短发夹RNA表达载体。     

内质网伴侣分子GRP78在胆管癌细胞中的作用研究

目的:研究葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)在胆管癌细胞中的表达及其对胆管癌细胞增殖和迁移的影响.方法:体外培养胆管癌细胞QBC939、RBE和HCCC-9810,应用Western blot检测GRP78的表达,用CCK-8比色法和Transwell小室迁移实验检测GRP78对胆管癌细胞增殖和迁移的影响.结果:胆管癌细胞中GRP78呈高表达,且GRP78的高表达不依赖于内质网应激.干扰GRP78表达显著抑制胆管癌细胞的增殖和迁移(P＜0.05).结论:GRP78对胆管癌细胞的增殖和迁移起重要促进作用,GRP78在胆管癌治疗中具有潜在的靶点价值.     

胃癌组织中GRP78的表达与临床病理特征的相关性分析

目的探讨胃癌组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达与临床病理特征的相关性及其与胃癌发生、发展的关系。方法收集临床资料完整的胃癌组织蜡块76例、胃正常组织蜡块(含正常胃黏膜组织及癌旁正常胃组织)20例制成组织芯片,免疫组化SP法检测其GRP78蛋白的表达。结果胃癌组织、胃正常组织中均有GRP78蛋白的表达,胃癌组织表达指数为(5.80±3.45),胃正常组织表达指数为(3.20±1.70),两组比较差异有统计学意义(P=0.002)。胃癌组织中GRP78蛋白的表达随肿瘤分化程度的降低而增强(P=0.001),但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、浸润深度等无关。结论胃癌组织中GRP78蛋白的表达增高,并与胃癌的分化程度密切相关。     

Expression of GRP78 in gastric cancer and its correlation with the clinical pathological characteristics

目的 探讨胃癌组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达与临床病理特征的相关性及其与胃癌发生、发展的关系.方法 收集临床资料完整的胃癌组织蜡块76例、胃正常组织蜡块(含正常胃黏膜组织及癌旁正常胃组织)20例制成组织芯片,免疫组化SP法检测其GRP78蛋白的表达.结果 胃癌组织、胃正常组织中均有GRP78蛋白的表达,胃癌组织表达指数为(5.80±3.45),胃正常组织表达指数为(3.20±1.70),两组比较差异有统计学意义(P=0.002 ).胃癌组织中GRP78蛋白的表达随肿瘤分化程度的降低而增强(P=0.001),但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、浸润深度等无关.结论 胃癌组织中GRP78蛋白的表达增高,并与胃癌的分化程度密切相关.     

GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究

目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。     

葡萄糖调节蛋白78和钙网蛋白在外阴鳞癌中的表达及意义

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78(GBP78)和钙网蛋白(CRT)在外阴鳞癌(VSCC)中的表达情况.方法 采用免疫组化和Western blot方法检测GRP78和CRT在30例VSCC及15例外阴正常皮肤中的表达情况.结果 GRP78和CRT在VSCC组织中阳性细胞的平均光密度值分别为0.358 5±0.006 2和0.296 2±0.012 6,在正常外阴皮肤中分别为0.331 6±0.006 0和0.284 7±0.004 3,比较GRP78和CRT在VSCC和外阴正常皮肤中的表达,差异均有统计学意义(P＜0.05).Pearson相关分析结果显示:GRP78和CRT在VSCC中的表达呈正相关(R2=0.583,P＜0.001).GRP78和CRT在VSCC中的平均灰度值比值分别为0.66±0.21和0.84±0.15,在正常外阴皮肤中分别为0.34±0.11和0.65±0.17,比较两者在VSCC和外阴正常皮肤中的表达水平,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 GRP78和CRT的表达与VSCC的发生发展有关,两者在VSCC中的表达呈正相关.     

胃癌中葡萄糖调节蛋白78和葡萄糖调节蛋白94表达的临床意义及与预后的相关性

目的确定葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）和葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94,GRP94）与胃癌（gastric cancer,GC）临床病理特征及预后的相关性。方法应用Western blotting和免疫组织化学方法检测GC和切缘组织中GRP78和GRP94的表达;Kaplan-Meier或卡方检验GRP78、GRP94和临床病理资料与GC术后整体生存期相关性。结果 GRP78和GRP94蛋白主要表达于胃癌细胞的胞质及胞膜,其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期呈负相关,与分化程度正相关（P〈0.05）;GRP78、GRP94高表达及低表达GC患者术后平均生存时间分别为（23.51±2.32）个月和（37.54±3.24）个月、（21.31±1.46）个月和（40.02±2.19）个月,5年整体生存率分别为21.23%和41.42%、20.73%和43.86%（log-rank test,P〈0.01）,TNM分期、GRP78和GRP94是影响GC预后的独立因素。结论 GRP78和GRP94高表达可能是GC预后不良的分子标志物之一。     

胃癌中葡萄糖调节蛋白78的表达及其临床病理学意义

目的检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在胃癌组织中的表达,分析其临床病理学意义,探讨GRP78在胃癌发生发展中的作用。方法收集48例不同临床分期及不同分化程度胃腺癌及28例癌旁正常胃黏膜组织标本,分别应用RT-PCR、Western Blotting和免疫组化检测GRP78 mRNA和蛋白质的表达。结果与正常胃黏膜组织相比,胃癌组织中GRP78 mRNA及蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。免疫组化检测GRP78阳性表达定位于胞浆,在正常胃粘膜组织中GRP78阳性表达率为10.7%(3/28),高、中分化与低分化胃癌组织阳性表达率分别为59.4%(19/32)和93.8%(15/16);直径≥5 cm的胃癌组织中GRP78阳性表达率(88.9%,16/18)高于直径<5 cm的胃癌组织(60%,18/30),Ⅲ、Ⅳ期(TNM分期)病例胃癌组织中GRP78阳性表达率(90.5%,19/21)高于Ⅰ、Ⅱ期病例(55.6%,15/27);5年内病情复发或者死亡病例胃癌组织中GRP78阳性表达率(82.8%,24/29)高于5年内病情无复发病例(52.6%,10/19);淋巴结转移胃癌组织中GRP78阳性表达率(96.2%,25/26)明显高于非淋巴结转移胃癌组织(40.9%,9/22),各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 GRP78在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期及预后密切相关。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭、转移的作用

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法 构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果 转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论 GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

分子伴侣GRP94在胰腺癌中的表达及意义

目的:探讨胰腺癌组织中葡萄糖调节蛋白94(GRP94)的表达及其与胰腺癌分化程度、临床分期及转移等的关系。方法:采用免疫组织化学法分别检测胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织GRP94表达情况,结合临床病理特征光学显微镜下用半定量法对结果进行统计分析。结果:正常胰腺组织、癌旁组织及胰腺癌组织均有GRP94的表达,其表达水平呈递增趋势。表达水平随细胞分化的降低、临床分期的增加及肿瘤转移而升高,但与性别、年龄无关。结论:GRP94的高表达可能参与胰腺癌的发生、发展,对胰腺癌细胞有保护作用,抑制GRP94的表达有可能抑制肿瘤的生长。