超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

微泡超声造影剂的研究进展

根据近年来微泡超声造影剂的国外研究进展,阐述了微泡超声造影剂的制法、靶向制备技术、体内过程和物理原理,并讨论了其在治疗上的应用和发展前景.     

靶向微泡超声造影剂的研究进展

近年来随着超声技术的不断发展,超声造影在临床诊断和治疗方面都展现出了巨大的潜力,尤其在肿瘤诊疗方面,以超声靶向微泡造影剂为基础的超声靶向转运系统显露出显著的优势。常规的给药途径使化疗药物杀死肿瘤细胞的同时,     

超声微泡造影剂用于基因转染方面的辐照参数优化

随着微泡作为一种新型基因载体可行性[1]研究的逐步深入和超声介导微泡破坏增强基因转染机制认识的不断加深,超声与微泡在基因治疗领域中的应用日益广泛。目前,国内外学者在这方面开展了大量的研究,在其过程中超声辐照参数的选择尤为重要,如何选择最佳的超声辐照条件是许多学者     

超声微泡造影剂介导血管生成素-1基因治疗下肢缺血

目的:探讨用超声微泡造影剂介导血管生成素-1(Ang-1)基因治疗兔下肢缺血的可行性?方法:将15只新西兰大白兔左侧股动脉及其分支切断结扎后随机分成3组:A组采用局部注射pEGFP/Ang-1质粒与超声微泡造影剂的混合物并用超声照射;B组采用局部注射pEGFP/Ang-1质粒;C组注射生理盐水作为对照组?治疗4周后进行血管造影,了解新生血管情况,免疫组化方法检测Ang-1的蛋白表达?结果:在侧支循环建立?胞浆棕褐色程度?新生血管方面,A组较多,B组其次,C组较少?结论:用超声微泡介导的Ang-1基因转染,可促进缺血骨骼肌的血管新生和侧支循环建立,为下肢缺血性疾病的基因治疗提供了一种新的途径?     

低频超声联合微泡造影剂通过激活内质网应激逆转前列腺癌紫杉醇耐药

目的 探讨低频超声联合微泡造影剂辅助紫杉醇逆转前列腺癌耐药的作用和机制.方法 筛选超声辐照紫杉醇耐药前列腺癌细胞株PC-3R的非毒性照射时间;将PC-3R细胞随机分为对照组、紫杉醇组(PTX组)、低频超声组(LFUS组)、紫杉醇和低频超声组(PTX+LFUS组),以及紫杉醇和低频超声联合微泡剂组(PTX+ LFUS+ UCA组),分别进行干预.AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡;q-PCR法检测各组细胞Bcl-2和多耐药基因表达变化;Western blot检测各组细胞GRP78和c-jun蛋白表达.GRP78 siRNA转染PC-3R细胞,微泡和低频超声联合处理后,Western blot检测GRP78蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡情况.结果 低频超声照射频率1 MHz,强度1.2 W/cm2,非毒性照射时间为10 s.与单纯应用紫杉醇相比低频超声辅助紫杉醇处理前列腺耐药细胞可显著提高细胞凋亡率(P＜0.01),联合微泡剂照射后,凋亡率进一步提高(P＜0.01),并下调Bcl-2和多耐药基因的表达.PTX+ LFUS+UCA组内质网应激相关蛋白GRP78的表达较PTX组和PTX+LFUS组升高,c-jun的表达下降(P＜0.01).应用siRNA干扰GRP78基因表达后,细胞凋亡率下降(P＜0.01).结论 低频超声联合微泡造影剂通过激活内质网应激,抑制其下游JNK/c-jun通路下调多耐药基因及凋亡抑制基因的表达,提高化疗药物诱导细胞凋亡的作用,逆转肿瘤细胞的耐药性.     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

超声联合微泡造影剂对大鼠肾脏微血管通透性的影响

目的研究高机械指数诊断超声爆破微泡造影剂对大鼠肾脏微血管通透性的影响。方法实验中以伊文氏蓝(Evans blue,EB)为示踪剂检测超声爆破微泡对正常大鼠肾脏组织微血管通透性的影响。15只健康Sprague Daw-ley大鼠,雌雄不限,随机分为A、B、C三组,每组5只,A组为单纯注射EB组;B组为注射EB后接受超声辐照组;C组为注射EB和微泡后再接受超声辐照组。使用西门子S2000超声诊断仪,4P1探头,辐照方式为连续辐照。三组采用相同的频率(2MHz)、机械指数(1.4)、微泡剂量0.5ml/kg,超声辐照时间1min。15只大鼠均在EB注射30min后灌注、取材,使用Image-Pro Plus 6.0软件测量肾脏表面EB渗出面积百分比;使用激光共聚焦显微镜观察肾脏微血管周围EB外溢情况并进行视觉评分;使用标准曲线和分光光度法测量各组大鼠肾脏组织中EB含量,作为反映血管通透性的指标。结果 A组肾脏表面无EB渗出,B组肾脏表面有微量EB渗出,面积百分比为(0.089±0.013)%,C组肾脏表面有部分EB渗出,渗出面积(17.596±0.243)%明显高于A组和B组(P<0.05);C组激光共聚焦显微镜下可见肾脏微血管周围EB外溢,视觉评分等级为2级,显著高于A组(0级)及B组(0～1级);C组肾脏组织中EB含量为(28.11±0.97)μg/g,比A组(11.48±1.05)μg/g和B组(13.18±1.28)μg/g明显增加(P<0.05)。结论高机械指数超声联合微泡造影剂可使肾脏微血管通透性增加。     

超声微泡造影剂与靶向治疗

基因治疗是近年来生命科学研究的热点，但迄今为止缺乏安全、高效的基因载体及基因转移方法，目前常用的病毒载体存在免疫原性和致突变性，而裸质粒等非病毒载体又存在转染率低、靶向性差等缺陷。因此，发展安全、高效、可控、简便实用的基因载体及基因转移方法己成为基因治疗研究的重点。超声医学在长期发展中，从诊断超声、治疗超声走向两个新的应用领域：药物输送和基因治疗。微泡（microbubble）的使用已被证明可以大大提高超声效应即基因或药物转染效率。     

超声微泡促腺病毒载体转染MDR1基因效率的体外实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在体外促进腺病毒载体介导的MDRl基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,并初步探讨其安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒MDRl基因转染组(B)、腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(C)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染组(D)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(E).收集各组细胞,应用RT-PCR法、流式细胞技术等分别从基因、功能及细胞生物学特性等方面检测外源性MDR1基因在骨髓单个核细胞内的功能性表达及安全性.结果 收获高滴度的Ad5-MDR1腺病毒载体并成功制备腺病毒微泡造影剂;RT-PCR结果 显示,除A组外其余4组在194 bp处均观察到特异性MDR1电泳条带,证实外源性MDR1基因通过腺病毒载体整合到细胞基因组中,且E组MDR1电泳条带的光密度比值明显高于B、C、D组(P<0.05);柔红霉素排出实验证实外源性MDR1基因表达产物P-gP有药物外排泵功能,且E组P-gp阳性率最高(P<0.05),而柔红霉素阳性率显著降低;一定强度的超声辐照及微泡造影剂对骨髓单个核细胞的细胞周期无明显影响.结论 低频超声波击碎微泡造影剂,能促进以腺病毒为载体介导的外源性MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,且安全可行.     

Inhibitory effect of ultrasound microbubbles carrying HSV1-TK gene combined with ganciclovir on prostate cancer cells

目的 观察超声微泡造影剂携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸昔激酶(HSV1-TK)基因体外转染及联合前药更昔洛韦(GCV)对前列腺癌细胞株PC-3的抑制效应.方法 超声辐照PC-3细胞,MTT筛选出最适辐照时间;将含有HSV1 -TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面,采用最适超声辐照转染,并用荧光显微镜及Western blot观察TK基因的转入及表达;MTT法观察使用不同浓度的前药更昔洛韦(GCV)后细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测最适浓度的前药GCV对转染后的前列腺癌细胞PC-3的周期的影响;MTT法观察HSV1-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌PC-3细胞杀伤效应.结果 MTT检测显示超声强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz,辐照时间30 s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;通过超声辐照后HSV1-TK基因可以顺利转入PC-3细胞中并有稳定的表达.与对照组相比,当前药GCV浓度在100μg/ml时,超声+微泡+TK组细胞杀伤率明显高于其他各组,细胞存活率约32％,低于其他各组(P＜0.05);流式细胞术检测显示大多数细胞被阻断在S期,细胞生长受到明显抑制.结论 以超声辐照微泡造影剂为载体转染自杀基因联合前约GCV,对人前列腺癌细胞有明显杀伤作用.     

双氢青蒿素联合顺铂对膀胱癌细胞增殖的抑制作用

目的：初步了解双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）联合顺铂（cisplatin,DDP）抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭转移的作用。方法：以膀胱癌细胞T24/5637为研究对象,通过CCK-8分别检测2种细胞系对DDP及DHA的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）;流式细胞仪检测DHA与DDP单独及联合应用时对2种细胞系周期和凋亡的影响;划痕实验、Transwell实验检测DHA与DDP单独或联合应用时对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响。结果：DDP对5637细胞的IC50为17.10μg/mL,对T24细胞的IC50为15.28μg/mL;DHA对5637细胞的IC50约为24.08μg/mL,对T24细胞的IC50约为32.27μg/mL。DHA/DDP单独用药组阻滞G0/G1、S期作用弱于联合用药组（P<0.05）,单独用药及联合用药对G2/M期的抑制作用无统计学意义。DHA联合DDP可使T24、5637细胞凋亡率明显高于DHA/DDP单独应用（P<0.05）,DDP诱导细胞凋亡率明显高于DHA...     

Bloom解旋酶基因RNA干扰载体对前列腺癌PC3细胞的抑制作用

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制前列腺癌PC3细胞系中Bloom解旋酶基因的表达,探讨Bloom解旋酶基因表达下调后对PC3细胞的抑制作用.方法 使用实验室前期成功构建的两条针对于Bloom解旋酶基因的RNAi载体shRNA-1和shRNA-2转染前列腺癌PC3细胞,以未转染RNAi载体为对照组,分别在转染24、48、72h后通过MTT法检测细胞增殖情况,转染48 h后通过Transwell小室法检验细胞侵袭、迁移能力,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡情况.结果 转染RNAi载体后,与未转染对照组相比,各实验时间点的转染组细胞增殖率降低(P＜0.05),Transwell细胞侵袭和迁移实验中穿过室膜的细胞数与对照组比均减少(侵袭:119±24、118±30 vs 227±38;迁移:122±13、121±47 vs 277±32,P＜0.05),划痕愈合率与划痕迁移距离均降低,48 h时差异有统计学意义(P＜0.05),而且细胞凋亡明显增加.结论 以RNAi载体干扰Bloom解旋酶基因的表达可抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进其凋亡,为前列腺癌的靶向基因治疗提供了依据.     

赫赛汀与阿霉素序贯联合应用对乳腺癌细胞抑制作用的研究

目的 探讨体外实验中赫赛汀(HER)与阿霉素(ADM)联合的最佳序贯方式;赫赛汀对于阿霉素作用的影响及机制.方法 利用MTT法及流式细胞技术测定HER、ADM不同序贯联合应用对人乳腺癌细胞(MDA-MB453)的抑制率及细胞周期的影响.结果 不同序贯方式联合应用组抑制率明显高于单药化疗组(P＜0.01),在化疗后12h或更长时间使用赫赛汀可取得协同作用.随着HER与ADM序贯方式的改变,G0/G1、S期比例逐渐下降,G2/M期比例逐渐升高.结论 应用阿霉素12h后使用赫赛汀可取得协同作用;序贯应用的差异与细胞周期的变化有一定关系.     

5-氟尿嘧啶联合人参皂苷Rg3抑制胃癌细胞的增殖

目的探讨5-氟尿嘧啶（5-Fu）联合人参皂苷Rg3对胃癌细胞增殖的抑制作用。方法MTT法检测5-FU联合Rg3对人胃癌细胞MGC-803和MKN-28细胞增殖的抑制作用。构建体外肿瘤球模型研究5-FU联合人参皂苷Rg3对肿瘤球的生长抑制作用;流式细胞仪检测5-FU联合人参皂苷R驴对MKN-28细胞的凋亡诱导作用“构建胃癌裸鼠移植瘤模型,随机分为生理盐水组（阴性对照组）、5-FU组、Rg3组和5-Fu＋Rg3组（联合给药组）;研究5-Fu联合人参皂苷Rg3对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,统计各组肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线。结果MGC-803胃癌细胞和MKN-28胃癌细胞给药48h后,联合给药组细胞存活率显著低于其他组,差异具有统计学意义（P〈0．01）。MGC-03胃癌细胞肿瘤球和MKN-28胃癌细胞肿瘤球给药7d后,联合给药组肿瘤球体积显著小于其他组,差异具有统计学意义（P〈0．01）。细胞凋亡实验结果显示：联合给药组诱导肿瘤细胞凋亡能力显著强于其他组,差异具有统计学意义（P〈0．01）。荷瘤裸鼠实验结果显示：各给药组均能有效抑制肿瘤的生长,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．01）。联合给药显著延长荷瘤裸鼠的中位生存期,差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论5-Fu与Rg3均具有抗胃癌细胞的作用,二者联合应用是一种潜在的治疗胃癌的有效手段。     

苦藏花素协同吉非替尼抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用研究

目的 观察苦藏花素协同吉非替尼对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用。方法 采用Cell Counting Kit-8（CCK8）检测单独用药（苦藏花素、吉非替尼）和联合用药（苦藏花素+吉非替尼）组不同浓度药物处理24,48,72h对A549细胞增殖的抑制作用;使用两药相互作用系数（Coefficient of Drug in Interaction, CDI）来评价吉非替尼和苦藏花素的相互作用性质。结果 苦藏花素和吉非替尼对A549细胞的增殖均有不同程度的抑制作用,在一定范围内与药物浓度呈正相关,且存在时间依赖性;其中,160ug/ml剂量的苦藏花素和低剂量吉非替尼(10ug/ml)协同抑制作用,可以达到高剂量吉非替尼(20ug/ml)单独用药的抑制作用。160ug/ml的苦藏花素和一定浓度范围内的吉非替尼CDI值小于1。结论 苦藏花素联用半量吉非替尼可以达到全量使用吉非替尼的抑制效果,提示苦藏花素联用吉非替尼可以协同抑制肺癌细胞A549的增殖。