缺氧对海马神经元培养的影响及巴曲酶的保护作用—HSP70的表达及细胞形态学的研究

本文采用新生大鼠海马神经元培养技术，以细胞形态学及ＨＳＰ７０免疫阳性细胞表达为指标，首次观察了巴曲酶对缺氧海马神经元损伤的直接保护作用。结果发现：在缺氧前０．５ｈ给予巴曲酶（０．５ＢＵ／ｍｌ），海马神经细胞存活率以及ＨＳＰ７０免疫阳性细胞率均明显高于缺氧对照组（Ｐ＜０．０１），而在缺氧前２４ｈ给予巴曲酶后，二者与缺氧对照组均无明显差别。表明：巴曲酶对缺氧海马神经细胞损伤有直接的保护作用，而且其作用与给药的时机有关。     

缺氧对海马神经元培养的影响及巴曲酶的保护作用—HSP70的表…

本文采用新生大鼠海马神经元培养技术，以细胞形态学及ＨＳＰ７０免疫阳性细胞表达为指标，首次观察了巴曲酶对缺氧海马神经元伤的直接保护作用。     

nNOS抑制剂在大鼠海马缺氧损伤的保护作用

目的为进一步证实缺血、缺氧时神经原性ＮＯ的神经毒性作用。方法在大鼠离体海马脑片上,应用微电极记录技术,研究ｎＮＯＳ抑制剂７－ＮＩ对缺氧所致神经元损害的保护作用。结果ｎＮＯＳ抑制剂７－ＮＩ对海马脑片缺氧后群峰电位（ＰＳ）变化较对照组显著减小。结论７－ＮＩ对海马脑片缺氧损伤有明确保护作用。作用机理可能是７－ＮＩ抑制ｎＮＯＳ活性降低缺氧后海马神经原性ＮＯ的过多形成,从而提高海马脑片抗缺氧损伤的能力,更加明确了缺氧早期神经原性ＮＯ的神经毒性作用。     

ATP敏感性K^＋通道在海马缺氧损伤中的作用

目的研究ATP敏感性K 通道阻断剂glipizide（GLI）对缺氧后海马脑片损伤以及海马神经元[Ca(2 )]i变化的影响。方法以大鼠离体海马脑片和体外分散培养的海马神经元为标本，分别采用电生理微电极记录技术以及激光扫描共聚焦显微镜监测神经元[Ca(2 )]i的方法。结果预先用GLI（20μmol／L）灌流的海马脑片缺氧后PV持续时间较对照组显著缩短，提示其加重了海马不可逆缺氧损伤的发生；另外急性缺氧可诱导海马神经元[Ca(2 )]i迅速升高，而预先加入GLI（20μmol／L）能显著加剧[Ca(2 )]i的升高程度。结论ATP敏感性K 通道在缺氧过程中的开放对大鼠海马脑区具有重要的保护作用，它可显著降低缺氧所致神经元[Ca(2 )]i升高，提高海马脑片的抗缺氧能力。这可能是其对抗海马缺氧损伤的主要作用机制之一。     

化学预处理对大鼠海马脑片缺氧耐受性的影响及其与线粒体ATP敏感性钾通道的关系

目的:探讨3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对海马脑片缺氧损伤的保护作用及线粒体内膜ATP敏感性钾(Mi-toK_(ATP))通道在预处理脑保护机制中的作用。方法:采用Nissl染色和透射电镜观察缺氧后大鼠海马CA_1区神经元密度、锥体细胞和亚细胞结构在预处理前后的变化,以及MitoK_(ATP)拮抗剂5-羟基癸酸盐(5-HD)孵育海马脑片对预处理效果的影响。结果:3-NPA组大鼠缺氧后海马CA_1区神经元密度(86.69±4.87)高于对照组(53.85±3.13,P<0.05),锥体细胞超微结构受损程度较对照组明显减轻。预处理大鼠海马脑片经100μmol/L 5-HD孵育后CA_1区神经元密度(57.31±7.89)较未孵育脑片降低(P<0.05),超微结构受损加重。结论:3-NPA预处理可提高海马脑片缺氧耐受能力,这种保护作用可能与MitoK_(ATP)通道开放有关。     

缺氧对大鼠海马脑片CA1区锥体神经元膜电位的影响

本文应用海马脑片细胞内记录技术，观察了ＣＡ１区锥体神经元膜的电学性质及缺氧对它的影响。发现缺氧可使锥体神经元膜电位呈现时相性变化，即缺氧早期（２－４ｍｉｎ）神经元膜电位出现超极化反应并伴随自发放电消失；缺氧４－７ｍｉｎ时膜呈现慢去极化，此时诱发电位逐渐消失；继续缺氧（８ｍｉｎ左右）膜出现快去极化直至膜电位的消失。用ＴＴＸ或无Ｃａ２＋人工脑脊液灌流脑片可显著地降低缺氧去极化幅度，延迟去极化的发生。结果提示，缺氧去极化的发生与Ｎａ＋、Ｃａ２＋跨膜内流有关。     

巴曲酶(DF-521)对大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型CD54表达的影响

目的：探讨巴曲酶对大鼠局灶性脑缺血后CD54表达的影响。方法：建立大鼠大脑中动脉缺血／再灌注(MCAO)模型，用免疫组化的方法观察CD54在脑缺血／再灌注后不同时间的动态变化，比较巴曲酶组和模型组的异同。结果：与模型组比较，巴曲酶组CD54阳性表达在脑缺血再灌注6h，3天，4天，7天均降低，6h降低最明显，主要位于神经元严重受损的缺血区。结论：巴曲酶对脑缺血／再灌注后CD54表达有降低趋势，     

人参皂甙Rb1对大鼠海马脑片缺血损伤的保护作用

目的 研究人参皂甙Rb1对脑缺血损的保护作用及其机制。方法 实验利用离体海马脑片模型，结合电生理学技术进行研究：(1)观察大鼠海马脑片在缺血条件下顺向群峰电位(orthodromic population spike，OPS)的变化及人参皂甙Rb1对它的影响。(2)观察谷氨酸对海马脑片OPS的影响及人参皂甙Rb1抗谷氨酸毒性作用。结果 (1)使用人参皂甙Rbl(600μmol／L)后，可使缺氧损伤电位(hypoxic injury potential，HIP)出现率明显减少，OPS恢复率和OPS恢复程度与对照组比较有显著性差异。(2)使用人参皂甙Rb1(600μmol／L)后，OPS恢复率和OPS恢复程度与对照组比较有显著性差异。结论 人参皂甙Rb1有明显的抗脑缺血损伤作用，其作用机制与抗谷氨酸的神经毒性作用有关。     

巴曲酶对大鼠颞叶梗死后空间认知障碍的改善和PDGF表达的影响

目的：探讨巴曲酶对单侧颞叶缺血性损害大鼠空间认知加工能力的改善作用及与ＰＤＧＦ表达的关系。方法：用Ｍｏｒｒｉｓ迷宫监测大鼠空间认知能力，行为。实验结束后取脑进行梗死体积测定及ＰＤＧＦ免疫组化分析。结果：（１）巴曲酶可以显著地缩短梗死大鼠在Ｍｏｒｒｉｓ迷宫中搜索目标的平均反应时和行程；（２）、巴曲酶组大鼠较多，较早地使用了正常的认知策略。巴曲酶治疗组颞叶梗死体积较单纯梗死组显著缩小，ＰＤＧＦ－Ａ表达     

在缺氧条件下培养的海马神经元形态结构及热休克蛋白70表达变化…

在体研究曾发现在缺血再灌注模型中，丹参具神经保护作用，本文采用新生大鼠海马神经元培养技术，以细胞形态学及ＨＳＰ７０免疫性细胞表达为指标，首次观察了缺氧条件下培养的海马神经元形态结构及ＨＳＰ７０表达变化及丹参的影响。结果发现：（１）不论缺氧１ｈ或２ｈ，在培养的海马神经细胞中，有的细胞出现细胞体周围光晕消失，胞浆内颗粒变性，细胞膜肥厚，粗糙，轴突变粗，断裂，并且出现ＨＳＰ７０免疫阳性细胞；（２）缺氧１     

巴曲酶对局灶性脑缺血再灌流大鼠成纤维细胞生长因子样免疫反应的影响

以往实验研究曾发现巴曲酶对脑血管病具有良好的神经保护作用。本文研究的目的为：巴曲酶是否还通过影响成纤维细胞生长因子起修复作用。用大鼠中大脑动脉（ＭＣＡ）线栓法脑缺血再灌注模型及免疫组化方法发现在缺血９０ｍｉｎ，再灌流４８ｈ后，缺血侧皮层、尾壳核及海马区ｂＦＧＦ样免疫反应细胞增加及神经细胞变性。在缺血后给予巴曲酶（８ＢＵ／ｋｇ），ｂＦＧＦ样免疫反应加强，并且缺血对侧相应ＭＣＡ供血脑区也可见轻度的ｂＦＧＦ样免疫反应改变，神经细胞变性之程度较轻。提示：巴曲酶对脑缺血再灌注的保护作用可能与它加强ｂＦＧＦ的修复作用有关。     

低温对大鼠海马脑片缺氧无糖损伤的保护作用及其机制

目的利用离体海马脑片孵育液和电生理学技术研究低温对脑缺氧/无糖损伤的保护作用及其机制.方法 (1)观察大鼠海马脑片在缺氧/无糖条件下顺向群峰电位(orthodromic population spike,OPS)的变化及温度对它的影响;(2)用高效液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)荧光法检测温度对缺氧/无糖导致的海马细胞外兴奋性/抑制性氨基酸(excitabilitory and inhibitory amino acid,EAA/IAA)水平变化的影响.结果 (1)37℃组海马脑片缺氧/无糖时缺氧损伤电位(hypoxic injury potential,HIP)出现率为87.5%(7/8),复氧/供糖1h后OPS恢复率为12.5%(1/8).低温组(32℃、25℃)OPS消失时间和HIP出现时间明显减少(P<0.01),复氧/供糖1h后OPS恢复程度(41%±34%、79%±33%)与37℃组(7.5%±21.2%)比较有显著性差异(P<0.05),而这3项指标25℃优于32℃;(2)37 ℃组缺氧/无糖时,EAA和IAA比对照组均显著增加(P<0.01),兴奋性毒性指数(excitory toxicity index,ETI)显著上升(P<0.01).复氧后各氨基酸水平均有所下降.而低温组缺氧/无糖导致的谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)升高显著减少(P<0.01),GABA却随着复氧时间的延长逐渐增加(P<0.01),ETI明显降低(P<0.01).这种效应25℃优于32℃.结论低温有明显的抗海马脑片缺氧/无糖损伤作用,其作用机制可能与低温维持了EAA和IAA的动态平衡,降低了EAA的兴奋性毒性作用有关.而其作用又以25℃优于32℃.     

巴曲酶对沙土鼠海马CA1区的神经元保护作用的量效、时效及可能机制的探讨

目的 探讨巴曲酶对沙土鼠前脑缺血再灌注海马CA1区神经元保护作用的可能机制及量效时效关系.方法 成年雄性蒙古沙土鼠170只,随机分成巴曲酶组132只、对照组及假手术组各19只.巴曲酶组又分为A组60只包括巴曲酶1～32BU/kg各剂量组,对照组及假手术组各10只,行TUNEL染色;B组72只分别为缺血再灌注后0～72h各时间点组,每时间点组9只,对照组及假手术组各9只,其中6只分别采用TUNEL染色检测海马CA1区的凋亡细胞及SP法检测海马CA1区的Bc1-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白的表达,3只行电镜下神经元超微结构的观察.光镜下用带刻度目镜计算沙土鼠海马CA1区的神经元阳性细胞数.结果 巴曲酶8BU/kg以上剂量组细胞凋亡率明显减少,与对照组、4BU/kg以下剂量组有显著差异(P＜0.01),8BU/kg以上剂量组之间无统计学意义(P＞0.05).不同时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数比较0h、1h、3h、6h、12h及24h亚组与对照组之间存在极显著性差异(P＜0.01).使用巴曲酶后,Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白表达明显增加,神经元阳性细胞数在巴曲酶各时间点与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),超微结构显示0～24h时间点较48h及72h时间点抗细胞凋亡明显.结论 巴曲酶具有明显的脑保护作用,其机制可能是通过上调Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白表达来达到脑保护作用的.巴曲酶的脑保护作用具有量效性及时效性,其最佳剂量为8BU/kg,72h内使用巴曲酶皆具有脑保护作用,尤以24h前使用效果明显.     

巴曲酶对沙土鼠海马CA1区神经元保护作用及其机制的研究

目的探讨巴曲酶对沙土鼠前脑缺血再灌注神经元保护作用的可能机制及时效关系。方法实验动物随机分为10组,分别为缺血再灌注后0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h组、假手术组及对照组,各个时间点分别给予腹腔注射巴曲酶8BU／kg,采用免疫组化SP法检测海马CA1区的Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白的表达,光镜下计算沙土鼠海马CA1区的神经元阳性细胞数。并行电镜下神经元超微结构的观察。结果使用巴曲酶后,Bcl- 2、eNOS、VEGF及Akt蛋白表达明显增加,神经元阳性细胞数在巴曲酶各时间点与对照组比较差异有显著性(P< 0．01),而巴曲酶0h-24h时间点之间比较差异无统汁学意义(P>0．05);Bcl-2、eNOS及VEGF神经元阳性细胞数在0h-24h时间点与48h-72h时间点比较差异有统计学意义(P<0．05);超微结构显示0h-24h时间点较48h及 72h时间点抗细胞凋亡明显。结论巴曲酶脑保护作用的机制可能是通过上调Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白的表达;72h内使用巴曲酶具有神经元保护作用,但在0h-24h时间点使用较48h及72h时间点保护作用更为明显。     

兴奋性氨基酸NMDA受体激动剂N-methyl-D-aspartate对大鼠海马 CA1区神经元膜电位影响

目的应用离体大鼠海马脑片,结合细胞内记录技术,研究兴奋性氨基酸NMDA受体激动剂N-methyl-D-aspartate对大鼠海马CA1区神经元膜电位的影响。方法海马脑片随机分为单纯缺氧组(Con组,n=10)、MK801组(n=10)和NMDA25μmol/L组(NMDA组,n=8)。Con组及MK801组的海马脑片分别给予10min缺氧或在缺氧期间应用含100μmol/L MK801的aCSF;NMDA组海马脑片在膜电位稳定15min后用含有25μmol/L NMDA的aCSF灌流10min。所有海马脑片均应用正常aCSF恢复60min。记录用药前或缺氧前膜电位、缓慢去极化的速率、快速去极化时间和快速去极化的幅度及恢复60min时神经元对细胞内注入电流及经Scheffer侧支刺激的反应。结果25μmol/L NMDA可以产生与缺氧相似的膜电位变化。但MK801组神经元的快速去极化时间显著高于NMDA组和Con组(P<0.05);NMDA组的快速去极化时间则显著短于Con组(P<0.05)。MK801组神经元的缓慢去极化速率为(0.08±0.03)mv/s,显著低于NMDA组的(0.44±0.12)mv/s及Con组的(0.22±0.05)mv/s(P<0.05)。在MK801组的10例神经元中,其中9例恢复对细胞内注入电流及经Schaffer刺激的反应,产生动作电位。结论兴奋性氨基酸NMDA受体的激活可能是神经元缺氧去极化的机制之一;而其受体拮抗剂MK801则可以显著抑制缺氧期间神经元膜电位的变化,促进复氧后神经元功能的恢复。     

巴曲酶对围产期缺氧缺血性脑损伤神经保护作用的研究

目的　制备宫内缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)动物模型 ,应用巴曲酶研究其对 HIBD的神经保护作用。方法　宫内窒息 2 0 min为实验组 ,并设立正常对照组 ,实验组随机分为两组 ,1组于生后 3 0 min、2 4h、48h各给予腹腔注射巴曲酶 (8BU/ kg) 1次 ,共 3次 (巴曲酶干预组 ) ,另 1组 (缺氧缺血组 )及正常对照组于相同时间给予腹腔注射等量生理盐水。3组仔鼠生后 72 h、7d、14 d、2 1d断头处死 ,测量脑组织含水量及重量 ,并应用 TU NEL法观察凋亡细胞数。结果　缺氧缺血组 72 h脑含水量明显高于巴曲酶干预组及正常对照组 (P<0 .0 5) ,其余时间点 3组脑含水量无差异。缺氧缺血组 72 h脑重量高于巴曲酶干预组及正常对照组 (P<0 .0 5) ,14 d、2 1d脑重量显著低于巴曲酶干预组及正常对照组 (P<0 .0 5) ;巴曲酶干预组脑重量 14 d、2 1d低于正常对照组 ,差异显著 (P<0 .0 5)。缺氧缺血组72 h～ 14 d各时间点阳性细胞数显著高于巴曲酶干预组及正常对照组 (P<0 .0 5) ,2 1d 3组阳性细胞数无显著差异 ;巴曲酶干预组 72 h～ 7d凋亡细胞数高于正常对照组 (P<0 .0 5) ,14 d降至正常 ;正常对照组各时间点偶见阳性细胞。结论　巴曲酶可明显减轻 HIBD急性期脑水肿及恢复期脑萎缩 ,抑制 HIBD神经细胞凋亡 ,具有神经保护作用     

巴曲酶对大鼠脑缺血再灌流损伤保护作用机理的研究

为探讨巴曲酶对大鼠短暂性脑缺血再灌流损伤引起的细胞凋亡有无抑制作用，参照Ｓｍｉｔｈ等（１９８４）方法，制备大鼠前脑短暂性缺血再灌流模型，采用ＴＵＮＥＬ（脱氧核苷酸转移酶末端介导的ｄＵＴＰ－生物素切口末端标记）法，观察了海马脑区细胞凋亡的特征变化—ＤＮＡ降解片段（凋亡小体）。发现脑缺血１０ｍｉｎ再灌流２４ｈ，海马ＣＡ１区即可见凋亡小体，于再灌流４８ｈ、９６ｈ凋亡小体明显增多。给予巴曲酶（１．６ＢＵ／ｋｇ．ｉｖ）后上述变化被明显逆转。本实验提示巴曲酶对脑缺血再灌流损伤所引起的细胞凋亡有抑制作用。     

巴曲酶对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机理的研究

用Ｓｍｉｔｈ等的方法制备大鼠前脑短暂缺血再灌注模型，在缺血１０分钟后，再灌注６小时缺血前脑ＯＨ、ＧＳＳＧ及ＧＳＳＧ／总ＧＳＨ比值明显增高；海马区组织病理学检查显示神经元有不同程度的变性及轻度坏死；海马ＣＡ１区细胞计数显示存活细胞明显减少。巴曲酶（１．６ＢＵ／ｋｇ）可明显地逆转上述氧应激状态，海马ＣＡ１区存活细胞比缺血组明显增多。巴曲酶对缺血神经元的保护作用可能是缓解氧自由基损伤的结果，似乎不是诱导热休克蛋白７０基因表达的结果。     

巴曲酶对局灶性脑缺血再灌流大鼠成纤维细胞生长因子样免疫…

以往实验研究曾发现巴曲酶对脑血管病具有良好的神经保护作用，本文研究的目的为：巴曲酶是否还通过影响成纤维细胞生长因子起修复作用，用大鼠中大脑动脉（ＭＣＡ）线栓法脑缺血再灌注模型及免疫组化方法发现在缺血９０ｍｉｎ再灌流４８ｈ后，缺血侧皮层，尾壳核及海马区ｂＦＧＦ样免疫反应细胞增加及神经细胞变性，在缺血后给予巴曲酶（８ＢＵ／ｋｇ），ｂＦＧＦ样免疫反应加强，并且缺血对侧相应ＭＣＡ供血脑区也可见轻度的ｂＦＧ     

实验性犬SAH后CVS血浆、CSF中ET、CGRP含量动态变化及巴曲酶的保护作用研究

采用放免法动态观察了２５只实验性犬ＳＡＨ后ＣＶＳ动物模型的血浆、ＣＳＦ中ＥＴ及ＣＧＲＰ含量变化及巴曲酶的保护作用。结果：单纯注血组及巴曲酶治疗组的血浆、ＣＳＦ中ＥＴ含量较对照组明显增高（Ｐ＜０．０１），ＣＧＲＰ含量明显降低（Ｐ＜０．０１）。单纯注血组在注血后３０ｍｉｎ血浆、ＣＳＦ中ＥＴ含量开始升高，ＣＧＲＰ含量开始下降，至第７ｄＥＴ达最高值，ＣＧＲＰ达最低值。经蛛网膜下腔及静脉注入巴曲酶０．４ＢＵ／ｋｇ／ｄ组，血浆及ＣＳＦ中ＥＴ含量均较同期单纯注血组明显降低（Ｐ＜０．０１），而ＣＧＲＰ则明显升高（Ｐ＜０．０１）。提示血浆、ＣＳＦ中ＥＴ、ＣＧＲＰ失衡是ＳＡＨ后ＣＶＳ的原因之一。巴曲酶可防止ＥＴ升高和ＣＧＲＰ降低。