骨髓源性肝样细胞门静脉移植大鼠肝纤维化模型

背景:研究已证明,骨髓间充质干细胞在体内、体外均可转化为肝细胞样细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能.目的:将骨髓间充质干细胞诱导分化的肝样细胞移植到同种大鼠已纤维化的肝脏,观察其分布、分化情况及对肝功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-03在泸州医学院附属医院实验室完成.材料:100 g清洁级雄性SD大鼠10只用于分离培养骨髓间充质干细胞并诱导分化为肝样细胞.200～250 g清洁级雄性SD大鼠75只,随机分为肝样细胞移植组30只,模型对照组30只,正常对照组15只.肝样细胞移植组及模型对照组大鼠腹腔注射四氯化碳制备肝纤维化动物模型.方法:模型对照组和正常对照组大鼠门静脉输注不含血清的低糖DMEM培养基,肝样细胞移植组输入DAPI标记的肝样细胞,移植后第1,2,3,4周处死大鼠,留取肝脏和血清标本.主要观察指标:肝组织Masson三重染色分期评估纤维化程度.肝脏冰冻切片荧光显微镜下观察肝样移植细胞定居情况.以全自动生化分析仪与放射免疫法检测血清肝功能指标和血清肝纤维化指标.结果:肝样移植细胞逐渐从血管进入肝脏实质,最终散布于肝细胞间,移植3周后,荧光衰减明显.移植后第2周,肝组织中的假小叶逐渐吸收或消散,纤维化程度明显轻于模型对照组,胶原染色变浅,分布于纤维间隔和汇管区,肝细胞呈气球样变性.移植后第4周肝细胞排列接近正常,偶见点状坏死,无纤维间隔,血清肝功能指标和肝纤维化指标与正常对照组相比,差异无显著性意义(P0.05).结论:诱导的肝样细胞植入纤维化的肝组织后,细胞可停留于汇管区和肝细胞素,植入细胞最早可见于移植后第7天,血生化检查结果提示植入诱导的肝样细胞能够部分替代肝细胞的功能.     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟.目的:探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性.方法:构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3 代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基:DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg 肝细胞生长因子.观察各组细胞形态变化,MTT 法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR 检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18 的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA 法检测培养上清液中转化生长因子β1 表达.结果与结论:正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率.     

大鼠骨髓间质干细胞体内诱导肝星状细胞的凋亡

背景:骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的疗效己得到很多实验的证实,但其机制仍不明确.目的:实验观察骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞的凋亡情况,初步探讨骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的机制.方法:连续8周皮下注射CCl_4诱导大鼠肝纤维化.造模成功后,20只大鼠随机分为实验组及对照组,每组10只.实验组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞,对照组经尾静脉注射DMEM培养液.于移植前,移植后第3,7天分别处死大鼠,取其肝脏行羟脯氨酸的检测,苏木精-伊红染色及masson染色,免疫组织化学检测α-SMA及α-SMA+TUNEL双染反映肝星状细胞活化及其凋亡情况.结果与结论:造模8周后,大鼠肝脏羟脯氨酸含最明显升高,病理呈进展性肝纤维化表现.移植7 d后,实验组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低,肝纤维化有所缓解,而对照组的肝纤维化程度继续加重.免疫组织化学显示,CCl_4注射8周后,α-SMA阳性细胞大量增生,移植后第7天,实验组α-SMA阳件细胞明显少于对照组(P＜0.05).移植后第3天,实验组肝星状细胞凋亡明显较对照组增加(P＜0.05).结果提示,骨髓间质干细胞移植有治疗肝纤维化的作用.骨髓间质干细胞诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的主要机制之一.     

人脐带源间充质干细胞静脉移植治疗大鼠肝纤维化

背景：近来国内外研究证明,来自其他组织的干细胞能够归巢到肝脏,并可能参与肝组织的再生,这为发展干细胞治疗肝脏疾病提供了新的希望。目的：探究人脐带源间充质干细胞的分离、培养方法,观察脐带间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化模型的修复作用,为脐带间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据。方法：自然贴壁法分离、纯化人脐带间充质干细胞并进行体外培养和扩增,用皮下多点注射CCl4制备肝纤维化大鼠模型。将22只模型大鼠随机分为模型损伤组（n=11）和细胞移植组（n=11）。细胞移植组在模型制备成功后的第1,2,3周经尾静脉给予1＆#215;106脐带间充质干细胞治疗,4周后将大鼠处死,收集各组大鼠血液检测肝功能;摘取肝脏行苏木精-伊红染色,观察病理变化;免疫组化法观察库普弗细胞的数量及分布;免疫组化法观察治疗组脐带间充质干细胞的定位情况。结果与结论：脐带间充质干细胞经尾静脉移植入肝硬化大鼠后,大鼠的肝功能均明显改善,与对照组比较,差异有显著性意义（P＜0.05）;肝组织苏木精-伊红染色提示,肝纤维化程度明显改善;免疫组化法观察库普弗细胞的数量提示,库普弗细胞数量明显减少;免疫组化方法利用抗BrdU抗体在治疗组大鼠肝脏观察到BrdU标记的脐带间充质干细胞。说明脐带间充质干细胞移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构。     

人胚胎骨髓间充质干细胞大鼠脾脏移植后向肝脏的迁移与分化

目的:研究人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内移植后向肝脏迁移和在肝内的分化.方法:将人胚胎骨髓间充质干细胞移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏,术后分时段取肝脏进行免疫组化染色,了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白8(CK8)、CK18、CK19的表达情况.结果:人胚胎骨髓间充质干细胞移植后10 d大鼠肝脏可见人CK8、CK18、CK19阳性细胞,移植后15 d大鼠肝脏组织内可见人ALB阳性细胞.移植后90 d仍有阳性细胞检出.结论:人胚胎骨髓间充质干细胞大鼠脾脏移植后能够向肝脏迁移并分化为人肝细胞.     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力

背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床。目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力。设计:析因设计。单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科。材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成。选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4 门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4 尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只)。方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5mL/100g。②CCL4 门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。CCL4 尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植。③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果。②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果。③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察。④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果。结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析。①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性。细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞。②骨髓间充质干细胞转染24h后即可见发绿色荧光的细胞。48～72h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞。作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞。③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异。④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞。且CCL4 门静脉移植组、CCL4 尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P<0.05)。结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切。正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关。     

不同途径移植骨髓间充质干细胞改善大鼠肝硬化

背景：骨髓间充质干细胞移植可减轻肝硬化程度,改善肝功能。目的：观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对四氯化碳诱导大鼠肝硬化的作用。方法：将60只SD大鼠随机分为正常组、对照组、门静脉移植组、肝动脉移植组、尾静脉移植组,后4组采用四氯化碳联合乙醇制作肝硬化模型,对照组不进行移植,其余3组分别经门静脉、肝动脉、尾静脉移植大鼠骨髓间充质干细胞1×106。结果与结论：移植4周后,与对照组比较,移植3组大鼠肝功能均得到明显改善,血清白蛋白、胆碱酯酶显著升高（P〈0.05）,转氨酶、胆红素、凝血时间、Ⅳ型胶原显著降低（P〈0.05）,肝纤维化程度显著减轻（P〈0.05）。门静脉移植组及肝动脉移植组优于尾静脉移植组,前两者之间差异无显著性意义（P〉0.05）。说明经门静脉、肝动脉、尾静脉移植骨髓间充质干细胞均可减轻肝纤维化程度,改善肝功能,但肝动脉及门静脉移植途径优于外周血静脉途径。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM＋体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基（HGM）＋体积分数5%胎牛血清;HGM＋5%正常大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清＋25μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

骨髓间充质干细胞对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的治疗作用的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的治疗作用及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响。方法将清洁级Sprague-Dawley大鼠分4组,A组(正常对照组)、B组(模型组)、C组(骨髓间充质干细胞移植组)、D组(水飞蓟素对照组)。另取sprague-Dawley大鼠制备骨髓间充质干细胞。除A组外,均皮下注射四氯化碳8周,完成后C组给予移植诱导后的骨髓间充质干细胞,D组给予水飞蓟素干预后化学发光法检测4组大鼠血清肝纤维化和肝功能指标,大鼠肝脏作组织病理学检查,分离各组大鼠肝星状细胞,流式细胞仪检测活化的肝星状细胞凋亡的变化。结果各组大鼠纤维化及肝功能结果:A、C、D组数据与B组对应数据比较,A组P<0.01,其余2组P<0.05。结论骨髓间充质干细胞能够显著改善四氯化碳所诱发的大鼠肝纤维化并能使肝星状细胞凋亡增加。     

骨髓间充质干细胞移植后的肝功能重建

背景:细胞移植是治疗肝功能衰竭的一种有效方法,而理想的细胞源和最佳的移植途径一直是各实验室不断研究的目标。目的:观察骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝功能重建的影响和最佳移植途径。方法:以D-氨基半乳糖胺作为肝脏毒剂,构建雌性SD大鼠急性肝衰竭模型。以雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞为细胞源,通过腹股沟静脉和脾内移植两种途径植入肝衰竭大鼠,动态检测多项肝功能血生化指标。并以sry基因为分子标志,采用PCR技术检测骨髓间充质干细胞在肝脏内的存活状态。结果与结论:骨髓间充质干细胞经腹股沟静脉和脾内移植均可降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素水平,提高白蛋白合成能力,改善肝功能,降低动物死亡率。经腹股沟静脉移植组死亡率低于经脾内移植组。移植后7～30d在受体大鼠肝脏内均能检测到sry基因阳性细胞的存在,而相应对照组未能检测到sry基因阳性细胞。结果表明①骨髓间充质干细胞移植可改善急性肝衰竭大鼠的肝功能。②骨髓间充质干细胞可在受体肝脏内存活。③经腹股沟静脉移植操作简便易行,死亡率较低,是较好的细胞移植途径。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的:探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化,为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法:实验于2005-05/06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者,应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质干细胞,应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化,采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中白蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达,通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果:①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80%～90%汇合,其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后,诱导组中出现圆形细胞,呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时,表达少量白蛋白核糖核酸,于诱导3周时可见白蛋白核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中白蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论:肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

骨髓间充质干细胞移植时机及移植时间长短对大鼠肝纤维化病变进程的影响

背景:研究发现肝纤维化环境是骨髓间充质干细胞适宜的分化环境,提示通过骨髓间充质干细胞移植治疗肝纤维化成为可能.目的:探讨骨髓间充质干细胞不同移植时期及移植时间长短对大鼠肝纤维化进程的影响.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-11/2008 08在福建医科大学及福建省科研所完成.材料:普通级五六周龄雄性SD大鼠5只用于制备骨髓间充质干细胞;清洁级成年雌性SD大鼠68只,分别于造模10周、12周后处死,前者分为对照组、造模第6周细胞移植组2个亚组,12只/组;后者分为对照组、造模第6周细胞移植组、造模第8周细胞移植组3个亚组,动物数量分别为16只,16只,12只.方法:各组大鼠均通过腹腔注射四氯化碳建立肝纤维化模型.取体外分离培养的第4代骨髓间充质干细胞悬液0.2 mL(含5×106个细胞),分别于造模后第6,8周经尾静脉注入各细胞移植组大鼠体内,对照组同法注入L-DMEM培养基,各组于培养对应时间点处死.主要观察指标:大鼠一般情况及肝纤维化和炎症程度.结果:①造模10周后处死:与对照组比较,造模第6周细胞移植组肝纤维化评分均值明显降低(t=-2.45,P=-0.023),炎症程度方面无明显差异(t=-0.60,P=-0.554).②造模12周后处死:对照组、造模第8周细胞移植组的肝纤维化及炎症程度评分均值均基本相似(t=-0.21,P=0.84;t=-0.18,P=0.86),2组均明显高于造模第6周细胞移植组(t=-6.17,t=-8.61,P＜0.01).③造模10周后处死与造模12周后处死比较:随细胞移植时间的延长,造模第6周细胞移植组肝纤维化及炎症程度评分均值均明显降低(t=-6.98,t=-9.78,P＜0.01).结论:早期移植骨髓间充质干细胞可以减轻CCl4引起的肝脏炎症程度,同时改善大鼠的肝纤维化程度,此作用与移植时间成正相关.     

骨髓间充质干细胞移植后的肝功能重建

背景：细胞移植是治疗肝功能衰竭的一种有效方法,而理想的细胞源和最佳的移植途径一直是各实验室不断研究的目标。目的：观察骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝功能重建的影响和最佳移植途径。方法：以D-氨基半乳糖胺作为肝脏毒剂,构建雌性SD大鼠急性肝衰竭模型。以雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞为细胞源,通过腹股沟静脉和脾内移植两种途径植入肝衰竭大鼠,动态检测多项肝功能血生化指标。并以sry基因为分子标志,采用PCR技术检测骨髓间充质干细胞在肝脏内的存活状态。结果与结论：骨髓间充质干细胞经腹股沟静脉和脾内移植均可降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素水平,提高白蛋白合成能力,改善肝功能,降低动物死亡率。经腹股沟静脉移植组死亡率低于经脾内移植组。移植后7～30d在受体大鼠肝脏内均能检测到sry基因阳性细胞的存在,而相应对照组未能检测到sry基因阳性细胞。结果表明①骨髓间充质干细胞移植可改善急性肝衰竭大鼠的肝功能。②骨髓间充质干细胞可在受体肝脏内存活。③经腹股沟静脉移植操作简便易行,死亡率较低,是较好的细胞移植途径。     

细胞移植对肝纤维化大鼠肝脏组织结构的影响

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs）诱导分化的肝样细胞对肝纤维化的治疗作用。方法采用红细胞裂解法体外分离培养雄性sd大鼠的BMSCs并加入细胞因子（肝细胞生长因子,HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）及制瘤素M（OSM）进行诱导,使BMSCs成为具有分泌AFP、清蛋白（ALB）等功能的肝样细胞,通过门静脉移植入肝纤维化模型大鼠体内后观察细胞的分布、分化情况及大鼠肝脏的光镜结构和超微结构的变化。结果肝纤维化模型大鼠经移植入诱导的肝样细胞后,肝细胞再生活跃,肝脏纤维组织明显减少,肝细胞超微结构基本恢复正常。结论肝样细胞移植对肝纤维化模型大鼠有明显的治疗作用。     

骨髓间充质干细胞肝中叶注射移植治疗新西兰大白兔肝脏衰竭

背景:肝细胞移植作为治疗肝脏衰竭的一种有效方法在各种动物模型及临床应用中得到广泛证实,但供体短缺及移植肝细胞增殖困难等问题严重困扰着肝细胞移植的发展.研究表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能,而且具有强大的增殖能力,它作为一种新的细胞来源为解决上述难题提供了新思路.目的:以肝中叶注射移植骨髓间充质干细胞治疗新西兰在白兔肝脏衰竭,验证其效果.方法:健康雄性新西兰大白兔给予D氨基半乳糖24 h后,移植组于肝中叶注射骨髓间充质干细胞悬液3 mL(1x109L-1),对照组注射相同体积不含骨髓间充质干细胞的培养液.移植后48 h、72 h、1周、4周取外周血测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性,移植后4周取肝脏做病理检测.结果与结论:移植后新西兰大白兔肝功能指标明显下降,存第4周时移植组谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性明显低于对照组(P＜0.05).移植后4周对照组表现为肝素紊乱.肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死,伴出血及炎性细胞浸润.移植组显示肝小叶结构可辨认,点状坏死肝细胞间再生肝细胞较前增多,汇管区、中央静脉及坏死灶周围可见核/浆比例较大的小细胞,并向肝组织内延伸,可见灶性增生.     

沉默RhoA基因对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的作用

背景:研究证实,RhoA基因在神经继发损伤中发挥着重要的作用,通过基因沉默降低其表达,可以有效阻断继发性神经损伤.RhoA蛋白介导的神经突生长抑制作用是影响骨髓间充质干细胞移植后修复效果的重要原因.目的:验证是否可以通过沉默RhoA基因的方法,改良骨髓间充质干细胞静脉移植对大鼠脑梗死的治疗效果.方法:体外培养骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,用Western blot法检测神经干细胞在转染前后RhoA基因的表达.建立大脑中动脉闭塞模型,分为3组,通过尾静脉分别注入RhoA基因沉默的骨髓间充质干细胞悬液、骨髓间充质干细胞悬液及不含干细胞的培养液(对照组).注入移植液后24 h,3 d,1,2 周行Bederson评分检测神经功能的损伤情况.造模2周后处死大鼠取材,行免疫组织化学和苏木精-伊红染色观察大脑梗死处组织学变化.结果与结论:经分子干扰RNA转染后24 h的骨髓间充质干细胞RhoA基因表达较转染前显著降低(P=0.002).沉默RhoA基因后的骨髓间充质干细胞移植治疗,无论从组织学上还是功能学上疗效都有明显的提高.提示用RNA干扰的方法使骨髓间充质干细胞的RhoA基因沉默,再通过尾静脉注射的方法移植到大鼠颅脑损伤区,移植的骨髓间充质干细胞可以更好地在损伤部位存活,增殖分化与迁移,促进脑梗死后大鼠神经功能的恢复.     

骨髓充质干细胞调控尿激酶型纤溶酶原激活物表达及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响

背景:骨髓间充质干细胞主要通过旁分泌及激活肝细胞生长因子促进肝星状细胞凋亡。目的:观察骨髓间充质干细胞对尿激酶型纤溶酶原激活物合成的调控及肝细胞生长因子活性的影响,探讨其诱导肝星状细胞凋亡的机制。方法:实验分为5组:①共培养组:大鼠骨髓间充质干细胞与肝星状细胞建立上下双层细胞共培养体系。②肝星状细胞单独培养组。③纤维原细胞对照组。④UK122干预组:在骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养6h前加入尿激酶型纤溶酶原激活物特异性抑制剂UK122。⑤骨髓间充质干细胞空白对照组。结果与结论:共培养组尿激酶型纤溶酶原激活物mRNA表达较肝星状细胞单独培养明显增加(P<0.01)。与肝星状细胞单独培养相比,共培养组的肝星状细胞在与骨髓间充质干细胞共培养24h后表现明显增殖抑制(P<0.01),且呈现时间依赖性;骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后,活性肝细胞生长因子的蛋白表达及肝星状细胞凋亡增加(P<0.01)。UK122干预后活性肝细胞生长因子表达及肝星状细胞凋亡减少(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞通过促进分泌尿激酶型纤溶酶原激活物,增加活性肝细胞生长因子表达,促进肝星状细胞凋亡。     

小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究

目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化。方法利用2／3肝部分切除术后36h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7d后，呈肝细胞样圆形，1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白。结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的：探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化，为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法：实验于2005-05／06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者，应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质于细胞，应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化，采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中自蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达，通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果：①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80％～90％汇合，其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后，诱导组中出现圆形细胞，呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时，表达少量白蛋白核糖核酸，于诱导3周时可见白蛋白．核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中自蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论：肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。目的:探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。方法:取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代,流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导:①M0组:不添加任何因子。②M1组:20μg/L肝细胞生长因子。③M2组:20μg/L肝细胞生长因子+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组:20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组:20μg/L肝细胞生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色,在诱导第14天时表达降低,21d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P<0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用,二者有协同作用。