一个含有25bp内含子的阴道毛滴虫Rabl-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rabl-like基因（TvRabl-like）及其内含子。方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析。结果 序列分析结果表明该eDNA克隆长705bp,开放阅读框具603bp,推测肽链含有200个氨基酸。序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rabl亚家族的亚型。进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rabl亚家族。基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5’GT-AG-3’和分支位点基序。RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在。结论 TvRabl-like基因属于阴道毛滴虫Rabl亚家族,该基因含有一个25bp的内含子。该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子。对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶cDNA克隆和序列分析

目的近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是,对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶基因,以便进一步探讨其功能。方法使用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库,用生物信息学进行TvRab11同源分析,鉴定TvRab11基因,用PCR方法扩增基因组DNA,TA克隆TvRab11cDNA、测序及序列分析。结果在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp,读码框含636bp,推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因,其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性最高(一致性60%,相似性79%),与人类Rab11b次之(一致性58%,相似性78%)。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域(RabF1-5)。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因,其功能有待进一步研究。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。     

阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。     

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。     

阴道毛滴虫AP33基因克隆与序列分析

目的:阴道毛滴虫黏附蛋白AP33基因的克隆与序列分析.方法:提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其克隆到pUCm-T 载体进行PCR、酶切及测序分析,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927 bp.测序结果目的基因与阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-1、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-2分别具99%、97%和94%的同源性.结论:成功克隆出阴道毛滴虫AP33基因序列,与已公布的AP33序列有很高的同源性.这为今后该蛋白的原核表达和大量制备提供一定的基础.     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫两个Sir2同源基因的克隆和功能

目的探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老的相关基因。方法从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出两个与酵母沉寂信息调节因子（Sir2）有较高同源性的cDNA克隆,分别命名为TvSir2和TvSir2-like,它们的编码框分别长915bp和1116bp。结果序列分析显示这两个cDNA克隆与酵母Sir2同源性很高,其氨基酸序列中含有Sir2p及其同源蛋白三个特征性保守结构域。分别从这两株cDNA克隆中扩增出表达片段植入表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coli BL21并用IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达到大量融合蛋白。用亲和层析法纯化的融合蛋白分别免疫豚鼠,获得的抗血清用Western-blot法识别到滴虫虫体全蛋白中大小为34000Mr和42000 Mr的条带。免疫荧光法检测TvSir2和TvSir2-like蛋白位于细胞核外的内质网和高尔基复合体区域。结论TvSir2和TvSir2-like克隆是酵酶Sir2的同源基因,为TvSir2和TvSir2-like在模式生物阴道毛滴虫的功能研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫硫氧还原蛋白过氧化物酶的cDNA克隆及序列分析

目的获取阴道毛滴虫硫氧还原蛋白过氧化物酶的cDNA克隆,研究其还原烷基氢过氧化物和氢过氧化物的抗氧化作用,以及调节由氢过氧化物介导的信号转换. 方法提取阴道毛滴虫的总RNA,用λTripIEx2噬菌体载体构建cDNA表达文库,阳性质粒cDNA克隆进行测序,并用生物软件RPS-Blast,NCBI Blast和ClustalW等对6个读码框架进行序列分析. 结果获得一株开放阅读框为588对碱基的cDNA克隆,推测肽链有196个氨基酸.序列分析表明,该肽链与衣滴虫过氧化物氧化还原酶(Prx1蛋白)及人的自然杀伤增强因子B分别有56%和61%的同源性;除了两个高度保守的半胱氨酸作用基序外,还有蛋白激酶C磷酸化和酪氨酸激酶磷酸化作用基序,N-豆蔻酰化作用位点,脂质运载蛋白信号位点等. 结论该蛋白有＞56%的可能性位于胞浆,和典型2-Cys Prx亚家族有很高(56%～62%)的同源性,很可能是其中的一个新成员.     

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因组结构分析

目的：了解５，１０亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）基因组外显子／内含子结构，为进一步的研究ＭＴＨＦＲ基因及寻找突变奠定基础。方法：根据报道的人肝ＭＴＨＦＲｍＲＮＡ序列设计引物，分段扩增基因组ＤＮＡ，进行双向测序，确定基因组序列。结果与结论：ＭＴＨＦＲ基因包括１１个外显子和１０个内含子，外显子的长度分别为９９～２５２ｂｐ，内含子长度分别为１９２～９８１ｂｐ。     

人类Vimentin基因第1,2,6,7内含子序列的测定

[目的]人vimentin(VIM)基因位于10号染色体短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因.目前已知全部外显子序列及部分内含子序列,本文测定了部分未知的VIM基因内含子序列.[方法]通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序.[结果]共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部序列;内含子7长404 bp,测得其全部序列.[结论]本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404 bp,与文献报道人类vi-mentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同.另外,文献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同.     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因的cDNA克隆与序列分析

目的对阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因进行cDNA克隆与序列分析。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫基因组RNA。以总RNA为模板,RT-PCR扩增黏附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线形载体,构建pMD-18T-ap65-3重组质粒,并进双行酶切﹑PCR鉴定及测序分析。结果RT-PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因。经凝胶电泳﹑PCR鉴定和限制酶切鉴定,成功的构建出pMD-18T-ap65-3重组质粒。序列分析表明,黏附蛋白65-3基因开放阅读框长为1 704 bp,与GenBank上公布的黏附蛋白65-3基因序列比较,其同源性高达99.6%。结论阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因体外扩增及测序的成功,为进一步研究阴道毛滴虫的致病机理及滴虫病防治方法奠定了基础。     

新的白血病相关基因LRP16的克隆

目的 发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制。方法 应用分子克隆技术ＲＬＧＳ及ＲＡＣＥ技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因。结果 克隆到一个长度为２９４８ｂｐ的ＤＮＡ片段,经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分,并定位于第１１号染色体长臂１１区,进一步克隆到这一基因的全长ｃＤＮＡ,其长度为９８０ｂｐ,并被国际基因库以新的人类基因ＬＲＰ１６收录入库。结论 ＲＬＧＳ及ＲＡ     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定

目的：克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因跨内含子基因组DNA序列。方法：利用跨内含子PCR方法,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果：DCA1基因跨内含子长度为4407bp,含7个外显子,由此推定的氨基酸序列长度为555个氨基酸残基;而CA1基因跨内含子长度为4473bp,含8个外显子,其推定的氨基酸序列长度为498个氨基酸残基。这2种基因的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT—AG规律。结论：首次克隆得到了杜氏盐藻DCA1和CA1基因跨内含子DNA序列。