肺炎链球菌小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性探讨

目的 构建肺炎链球菌（ATCC49619）小片段自溶素基因lytA′的原核表达载体,通过大肠埃希菌表达系统进行原核表达获得一种新型肺炎链球菌小片段自溶素重组蛋白LytA′,初步探讨该蛋白的体外抗菌活性,并与青霉素G同时进行比较。方法 设计lytA基因的特异性引物,并通过PCR方法从肺炎链球菌（ATCC49619）中扩增lytA基因,并将其插入原核表达载体PGM-T中,构建PGM-T/lytA重组质粒,使用限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ消化PGM-T / lytA获得小片段自溶素基因lytA′。再构建表达质粒pET-32a（+）/lytA′ 并转化到感受态细胞大肠埃希菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达目的 蛋白,使用透析袋等电点洗脱技术纯化回收目的 蛋白LytA′;采用微量肉汤稀释法分别测定LytA′和青霉素G对肺炎链球菌（ATCC49619）的最小抑菌浓度（MIC）,并将其作用于青霉素G敏感菌株肺炎链球菌（ATCC49619）,初步探讨小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性。结果 成功构建重组质粒PGM-T / lytA和pET-32a（+）/lytA′。小片段自溶素重组蛋白表达良好,并显示出预期的抗菌活性。与生长对照组相比,LytA′和青霉素G在3 h时显示出明显的抗菌活性（t=14.243 0,P<0.011 0;t=7.400 0,P<0.022 0）,抑菌效应持续至7 h （t=20.838 0,P<0.008 0;t=17.889 0,P<0.017 0）,抑菌效应逐渐增强。此外,在7 h时,LytA′ 的抑菌活性明显强于青霉素G（t=6.764 0,P<0.027 0）。结论 小片段自溶素重组蛋白LytA′对青霉素G敏感肺炎链球菌显示出一定的体外抑菌活性,且持续时间久,有成为抗肺炎链球菌感染治疗药物的可能性。     

肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定

目的 体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性.方法 分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性.结果 克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达.所获重组蛋白纯度达到95%.溶血实验显示 Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量依赖.细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525 μg/ml.结论 经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白.     

肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用

目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.     

肺炎链球菌热休克蛋白GrpE的表达、纯化及热稳定性研究

1. 重庆医科大学检验医学院临床检验诊断重点实验室,重庆　400016;2. 成都中医药大学附属医院检验科,成都　610072;3. 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆　400016;4. 重庆市渝北区人民医院医学检验科,重庆　402220     

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。     

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的 探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式.方法 分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA'和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply 点突变减毒体),免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA).将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA',C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21 d生存情况.结果 成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21 d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01).结论 PspA'联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合.     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达及免疫保护性研究

目的 利用基因工程技术获取原核表达的肺炎链球菌表面黏附素A(Psa A)蛋白并初步研究其对小鼠的免疫保护性.方法 根据基因库中psa基因序列设计合成特异性引物,从临床分离到的肺炎链球菌中提取DNA,PCR技术扩增目的 基因psaA,克隆后构建原核表达栽体PET-32a(+)/psaA,将重组质粒转化到大肠杆茵BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,获得重组蛋白,并通过Western-blot鉴定其免疫活性.将重组蛋白免疫小鼠,观察对肺炎链球茵感染动物的保护作用.结果 经酶切及测序鉴定,克隆出870bp的目的 基因,DNA序列与Gen-Bank中的相应数据符合率为100%;成功构建出原核表达载体pET-32a/psaA;经IPTG诱导,表达出了约57 kD左右的融合蛋白,与预期大小相符,并且具有抗体结合活性;重组PsaA蛋白对肺炎链球菌感染小鼠具有一定保护作用.结论 在原核细胞中成功表达出PsaA蛋白,能在一定程度上抵抗肺炎链球菌感染,为基于黏附素的新型疫苗的研究提供线索.     

肺炎链球菌耐药基因检测

肺炎链球菌 (StreptococcusPneu moniae,Sp)又称肺炎球菌 ,是肺炎、脑膜炎、鼻旁窦炎和中耳炎等疾病的重要病原菌。近年来 ,国内外均报道临床分离到的Sp菌株对青霉素、红霉素、四环素和喹诺酮类药物耐药性呈上升趋势 ,并出现了耐多药的Sp〔1〕 。细菌耐药基因的检测在临床用药指导、耐药细菌监测和细菌耐药机制研究诸方面均有重要意义。本文就Sp耐药基因检测的国内外现状作扼要介绍。1　青霉素耐药基因　　青霉素是治疗Sp感染的传统药物。其作用机制为青霉素 (包括其他 β内酰胺类药物 )与细菌细胞壁上的青霉素结合蛋白 (PBPs)不可逆地…     

肺炎链球菌毒力相关基因检测及临床意义

目的:检测肺炎链球菌临床分离株毒力基因存在情况。方法:以临床分离出的91株肺炎链球菌作为研究对象,利用PCR法对肺炎链球菌5种毒力基因实施检测。结果:在全部的91株肺炎链球菌中LytA、PsaA、NanA、PspA、Ply这5种基因的检测阳性率分别为94.5%、85.7%、85.7%、61.5%、82.4%。结论:肺炎链球菌毒力因子是肺炎链球菌致病的基础,5种常见的毒力基因在肺炎链球菌检测中,其阳性率都比较高,此实验为进一步阐明毒力因子的作用机制并应用于指导抗肺炎链球菌新药和新型疫苗研制奠定了一定的基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒PreS基因的克隆表达及亲和层析纯化

目的：获取乙型肝炎病毒前S区基因（HBVpreS),序列测定正确后进行融合表达,为今后研究其机制及应用创造条件。方法：利用乙型肝炎病毒基因组为模板体外扩增HBVPreS基因后进行基因克隆,目的基因经测序正确后克隆入融合表达载体pRSET-C中,转化大肠杆菌JM109（）DE3）。目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的HBV－PreS蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果：成功地扩增到preS区全长基因,得到融合6个His的HBV－PreS蛋白纯度大于90％,结论：构建了乙型肝炎病毒前S区基因的重组表达载体,获得了稳定表达的工程菌,为以后的深入研究奠定了基础。     

殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化

目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahH）基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒，转化到大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后，IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果: PCR扩增产物全长为1 410 bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在E.coli JM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50 000,诱导5 h蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4 g/L。Western blotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论:成功克隆了殊异韦荣菌sahH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架，且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的：克隆及表达人黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法：从人急性髓细胞白血病细胞系HL-60提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM-T-easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建高效表达克隆，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmoL／L异丙基-β—D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，PRAME蛋白表达即达高峰。结论：PRAME基因在极少数正常组织中低表达，而在白血病患者高表达，并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原，所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。     

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

目的：克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能。方法：从热休克的人肝癌细胞株SMMC－7721中，用RT－PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化，经SDS－PAGE电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定。结果：克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQTE-30HSP72载体 大肠杆菌中表达出与预大小相符的Mr为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白。结论：克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础。     

人白细胞介素-6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ ６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ ６ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ ６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ ６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ时均可获高效表达,最高表达量占菌体总蛋白的２６％。表达产物经变性复性及纯化后产品纯度达９８％,比活性为１１×１０８Ｕ／ｍｇ。结论：本研究为ｒｈＩＬ ６的中试生产奠定了坚实的基础     

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化

目的：从猪肾中提取RNA,从中克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶（GNE）基因,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达。方法：从猪肾中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出GNE基因,经测序,感受态大肠杆菌E.coli DH5a转化,质粒抽提,鉴定以及大肠杆菌BL21（DE3）转化表达,通过His-tag亲和纯化（Ni Sepharose 6 Fast Flow）,G-25柱脱盐,SDS-PAGE电泳检测。结果：RNA提取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77,说明无明显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段,测序证明该基因的ORF为1 206 bp,编码402个氨基酸组成的酶蛋白（GNE）。SDS-PAGE显示,纯化蛋白为45 kD的单一条带,与基因序列推测值一致。结论：GNE基因已被成功地克隆和表达。     

人类疱疹病毒6型U94基因克隆?表达?纯化及抗体制备

目的:制备人类疱疹病毒6型U94蛋白及其抗体.方法:PCR扩增U94基因,经测序后克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中.重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导蛋白表达.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.表达的蛋白经亲和层析纯化.纯化的蛋白免疫动物制备抗血清.结果:成功地获得了高纯度的U94融合蛋白,纯度可达90%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:100 000.结论:获得高纯度的U94融合蛋白及其高效价的抗体.