死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化.方法:设计针对DAPK基冈启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定.结果:所建市的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板.不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致.结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测.     

DNA甲基化PCR引物的设计

DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR,BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-sp…     

原位移植人肝癌裸鼠模型AFP基因的异常甲基化检测

[目的]研究原位异种移植肝癌模型AFP基因启动子区异常甲基化状态的检出状况,探讨其在肝癌发病机制研究中的应用.[方法]采用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序法(BSP),以人成纤维细胞基因组甲基化状态为正常对照,对10例原位移植人肝癌裸鼠模型肝癌组织中AFP基因启动子区甲基化状态进行分析和定位.[结果]10 例模型肝癌组织中AFP基因启动子区甲基化状态均发生了不同程度的异常.[结论]原位移植人肝癌模型的肝癌组织中可以检测到AFP基因启动子区的去甲基化变化,MSP和BSP作为简便而有效的技术组合可以应用于基因甲基化状态的鉴定中.     

甲基化特异PCR方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中p16肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法,特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态;在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D）呈甲基化状态;在检测的肿瘤标本中,60%肺癌组织及70%结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中p16基因异常形式之一,有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志,MSP方法有临床普及应用前景。     

DNA甲基化与肿瘤研究进展

细胞癌变是一个多阶段复杂过程 ,它包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活 ,并涉及基因和基因外的多种改变。近来 ,人们发现肿瘤细胞的总体甲基化水平低于正常细胞 ,而在某些CpG岛甲基化程度增高。DNA甲基化在X染色体、基因表达及基因组印迹中[1 ] 起着重要作用。同时 ,近年来研究发现DNA甲基化的异常影响肿瘤的发生发展。1　DNA甲基化与基因表达1.1　DNA甲基化与去甲基化　DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶 (DNAmethyltransferase ,DMT)的催化下 ,以s 腺苷甲硫氨酸 (SAM)为甲基供体 ,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲…     

食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化相关性

目的:使用启动子区CpG岛的甲基化特异性PCR(MSP),分析食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化的相关性。方法:对MT-3基因启动子区的用MSP检测方法,并以DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮2'-脱氧胞(5-aza-CdR)分别处理食管鳞状细胞癌组织及HET-1A细胞株,检测MT-3基因启动子区甲基化状态变化,Western blot检测蛋白表达。结果:食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区呈甲基化状态,HET-1A细胞株MT-3基因启动子区呈非甲基化状态。采用5'-Aza-dC去除食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区甲基化后,金属硫蛋白3表达水平上升了9.2倍。结论:MT-3启动子区CpG岛甲基化可能是导致金属硫蛋白3低表达的重要机制,其结果则导致食管癌发生。     

DNA甲基化导致肿瘤的分子机制

DNA甲基化是指在DNA甲基化酶的作用下,以S-腺苷酸-L-甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。基因的正常功能除了依赖于正常结构外,还依赖于正常的甲基化状态。DNA的异常甲基化在肿瘤发生中起重要作用。在肿瘤的发生过程中常常出现整个基因组甲基化水平的降低,而且特定癌基因也常呈低甲基化状态,而一些肿瘤抑制基因除了点突变或基因缺失外,启动子序列高甲基化致转录抑制,可使这些基因失活。本文对DNA甲基化引起肿瘤的机制予以综述。     

改良的甲基化特异PCR法在人宫颈癌Hela细胞检测中的应用

目的介绍一种CpG岛甲基化分析方法，即甲基化特异PCR法（methylation—specific PCR，MSP）以及对该方法的改良。方法用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后，进行甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，并对MSP法进行改良。应用该法分析人宫颈癌Hela细胞中RASSF1A、p16基因5＇CpG岛甲基化状态。结果发现人宫颈癌Hela细胞中有RASSF1A、p16基因的甲基化，改良后的MSP更容易获得较好的效果。结论MSP法是一种较为简便、灵敏和具特异性的甲基化检测方法，改良后该方法更加简便可行。     

DNA甲基化及其在宫颈癌中的研究进展

DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的第三种机制,DNA甲基化造成的基因异常对肿瘤的发生及发展有着重要的影响。DNA的甲基化的检测方法有酶切法、限制性酶切聚合酶链反应(PCR)、甲基化特异性PCR、亚硫酸盐测序、亚硫酸盐PCR-SSCP、MethyLight等。DNA甲基化在宫颈癌的早期发现、治疗以及预测肿瘤转移复发等方面均有重要的意义。     

METTL3m6A修饰调控与肿瘤发病机制的研究进展

<正>肿瘤的发病机制是当代学者研究的热点,表观遗传学研究的是基因组中与基因表达相关的可逆性遗传变化,即为一种不涉及基因序列改变的基因调控机制[1],包括DNA甲基化[2]、RNA甲基化[3]、染色质修饰构想变化[4]等。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是mRNA甲基化修饰最普遍的形式[5]。     

p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用

目的：建立p16基因中CpG岛的甲基化分析方法，即甲基化特异的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）方法及其初步应用。方法：用亚硫酸氢钠修饰变性后的被测DNA，随之进行甲基化，非甲基化特异的PCR扩增。应用MSP法分析白血病患者的白细胞p16基因5'CpG岛的甲基化变异情况。结果：用加热法变性DNA，亚硫酸氢盐修饰DNA,Wizard DNA纯化树脂除盐，纯化修饰后的DNA都获得了成功，并建立了MSP分析p16基因甲基化的方法。白血病患者的白细胞p16基因的5'CpG岛有一定比2例的甲基化变异。结论：MSP是一种较为简便，敏感，且具有高度特异性的检测任何基因的CpG区域甲基化位点的分析方法。     

原发性肝细胞癌RASSF1基因启动子甲基化检测及其临床意义

目的 检测原发性肝细胞癌RASSF1基因启动子甲基化状态并探索其作为新的肿瘤生物标志物在肝细胞癌诊断中的意义.方法 应用MSP和RT-PCR分别检测60例原发性肝细胞癌组织样本和癌旁组织RASSF1基因启动子甲基化状态和mRNA表达.结果 60例PHCC组织样本中有51例存在RASSF1基因启动子甲基化状态(85.0％),均检测不到mRNA表达,癌旁组织甲基化阳性率为5％,mRNA表达正常.RASSF1基因启动子甲基化与肿瘤病理分期和直径大小呈正相关关系,而与患者性别、年龄和血清AFP水平无关.结论 RASSF1基因启动子甲基化在PHCC的发病机制中起到重要作用,可以作为新的肿瘤生物标志物为PHCC诊 断和评估提供重要分子线索.     

散发性结直肠癌中hMLH1基因甲基化的实验研究

[目的]检测散发性结直肠癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态,分析该基因甲基化与患者临床病理特征的相关性.[方法]采用重亚硫酸盐修饰测序法检测患者肿瘤组织和配对正常组织hMLH1基因甲基化状态,采用免疫组化方法检测其蛋白表达水平,并将甲基化状态与相应的蛋白表达水平及临床病理学资料进行统计学分析.[结果]正常组织的所有CpG位点均为非甲基化.肿瘤组织中CpG岛1(CGI-Ⅰ)甲基化阳性率为20%(6/30).hMLH1蛋白表达阳性率为50%(15/30).经X2检验,CGI-Ⅰ甲基化组与非甲基化组的hMLH1蛋白表达阴性率有显著性差异(P<0.05);低分化组的甲基化阳性率(100%)显著高于高中分化组(14.29%)(P<0.05).[结论]hMLH1基因启动子区CpG岛1甲基化可能导致hMLH1蛋白不表达;甲基化还与肿瘤的分化程度存在关联,提示甲基化还可作为结直肠癌预后的参考指标之一.     

EB病毒基因甲基化与肿瘤的关系

EB病毒(EBV)中DNA甲基化导致了基因组的不稳定,对肿瘤发生起着重要作用。EBV启动子的失活主要是由于启动子被甲基化,EBV基因的高甲基化状态有助于其逃避免疫系统的监视作用,并长期存在于宿主细胞内。推测EBV可能通过表观遗传机制调控病毒基因启动子,尤其是通过EBV基因甲基化状态来调控病毒基因的表达,从而导致肿瘤的发生。EBV甲基化与多种肿瘤的发生发展密切相关,在此对EBV基因甲基化与肿瘤的关系进行简要综述。     

胃液脱落细胞DNA甲基化在胃癌中的生物学意义

目的:探索在胃癌患者胃液脱落细胞中检测肿瘤相关基因启动子区DNA甲基化的可行性,及其与临床病理之间的关系。方法:采用MSP(甲基化特异性PCR)方法,对117例胃癌及165例非胃癌患者胃液脱落细胞P16、DAPK(死亡相关蛋白激酶)、E-cadherin(上皮细胞钙黏蛋白)、hMLH1(错配修复基因)四种基因启动子区甲基化状态进行检测;并与组织、血浆检测结果进行比较。结果:不同标本四种基因异常甲基化的频率,胃癌组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。P16、E-cadherin、DAPK发生甲基化的频率,早期胃癌与进展期胃癌相比,差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌组胃液脱落细胞各基因甲基化状态与患者年龄、性别、肿瘤大小、H.pylori感染无关。结论:通过胃液脱落细胞检测肿瘤相关基因DNA甲基化有望作为检测胃癌的生物学标志物。     

肺癌细胞株E - cadherin的表达状态及其与启动子甲基化的关系

[目的]研究肺癌细胞株上皮钙粘蛋白(E - cadherin)的表达与基因启动子甲基化状态的关系.[方法]采用免疫细胞化学法检测肺癌细胞株NCI - H460、SPCA和A549的E- cadherin蛋白表达;半巢式甲基化特异性PCR法(MSP)和微流控芯片技术检测E- cadherin基因启动子甲基化状态.[结果]...     

比较MSP法与PS法检测胃癌组织中Runx3启动子甲基化

目的 探讨甲基化特异性聚合酶链法(MSP)和焦磷酸测序法(PS)检测Runx3基因甲基化的特异性. 方法 选取150例胃癌患者[依据美国癌症联合委员会(AJCC)分期标准,分肿瘤的早期,进展期两组]胃切除的胃癌标本及50例无癌变胃黏膜标本.分别以MSP法和PS法同时检测其Runx3启动子甲基化程度. 结果 胃癌组织与正常胃黏膜相比,其Runx3基因甲基化程度的差异均有显著性(MSP法:67.3％,40.0％,P=0.002;PS法:76.0％,30.0％,P＜0.001).MSP法显示:Runx3甲基化与肿瘤大小相关(P＜0.05);而PS法分析显示:进展期胃癌的Runx3基因甲基化率高于早期胃癌(P＜0.05);且其甲基化状态与肿瘤的大小(P=0.004)、Lauren分级(P=0.043)、浸润的程度(P＜0.001)、淋巴结转移(P=0.021)及肿瘤TNM临床分期(P=0.045)等临床病理特征之间存在相关性.结论 PS法与MSP法相比,敏感性更高,PS检测结果与临床病理学结果之间存在显著相关性.     

DNA甲基化芯片检测技术在恶性肿瘤诊疗中的应用

表观遗传学的改变普遍存在于各种恶性肿瘤中,DNA甲基化是表观遗传学改变的主要形式之一。DNA甲基化状态的改变可显著影响基因的表达,抑癌基因高甲基化及癌基因低甲基化是导致恶性肿瘤发生、发展的重要机制。因此,检测恶性肿瘤DNA甲基化状态的变化对于揭示其发病机制意义重大。近年来,DNA甲基化检测技术尤其是DNA甲基化芯片检测技术在恶性肿瘤发病机制、临床诊疗等方面得到越来越广泛的应用。     

DNA甲基化与肿瘤

摘要 DNA甲基化是肿瘤发生发展过程中较常见的表观遗传学改变,它与肿瘤的关系己成为肿瘤发病机制研究中的热点。DNA启动子区域甲基化被认为是除突变和缺失以外的抑癌基因功能失活的关键机制。抑癌基因启动子区域发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的,导致恶性肿瘤表型的表达,因而检测体液中相关基因的甲基化状态可用于肿瘤的早期诊断和预后分析。由于DNA甲基化是可逆的,如5-氮杂胞苷（5'-azacytidine）, 5-氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine）, zebularine等胞苷类似物正被用来治疗各种肿瘤,已展现出可喜的前景。本文对DNA甲基化概念、意义及应用的问题进行了综述。     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.