移植性C57BL/6小鼠FBL-3红白血病模型的建立及其生物学特性

目的探讨利用国内传代培养的FBL-3细胞建立H-2相合C57BL/6小鼠FBL-3红白血病模型的可行性,并观察模型的生物学特性。方法把FBL-3小鼠红白血病细胞经尾静脉接种C57BL/6小鼠,观察小鼠的生存时间和染色体变化,并对濒死小鼠的肝、脾、肺和肾进行病理检查,部分进行电镜检查。结果静脉接种1×10^3-1×10^7个白血病细胞,C57BL/6小鼠发病率分别为100%;接种细胞的数量与存活时间呈线性关系;白血病细胞主要侵及肝、脾、骨髓、肺和肾组织,糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均阴性。电镜下观察到细胞内病毒样颗粒。脾脏和骨髓细胞染色体多数为非二倍体,只表达H-2b。结论经尾静脉接种FBL-3细胞可建立C57BL/6小鼠红白血病模型。     

DBA／2 小鼠微小残留白血病模型的构建

 目的　探讨建立一种细胞系和种鼠传代方便、重复性好的微小残留白血病模型的方法。方法　选用国际标准近交系DBA／2小鼠84只，接种不同数量L1210白血病细胞，观察接种白血病细胞数量与小鼠存活时间之间的关系；每只小鼠接种L1210白血病细胞1×106个后，第3天行不同剂量环磷酰胺（CTX）化疗，观察化疗剂量与小鼠存活时间之间的关系。结果　小鼠存活时间随接种细胞数量增加而逐渐缩短；白血病小鼠存活时间随化疗剂量增加而逐渐延长；观察接种不同数量白血病细胞的小鼠和接受不同剂量CTX化疗的白血病小鼠的生存趋势，显示接种500个白血病细胞小鼠的存活时间相当于用CTX剂量125 mg／kg化疗白血病小鼠生存时间，两者均为28 d左右。结论　DBA／2小鼠接种L1210白血病细胞1×106个／只后第3天采用CTX 125 mg／kg化疗可以成功建立微小残留白血病模型，此时小鼠体内白血病细胞数约为500个。     

红色荧光蛋白标记的小鼠白血病模型的建立

 目的　利用红色荧光蛋白（DsRed）标记的小鼠淋巴瘤EL4细胞株,建立荧光标记的小鼠白血病模型,并对模型进行分析和鉴定。方法　将EL4／DsRed细胞以低剂量（5×102／只）、中剂量（5×103／只）、高剂量（2.5×104／只）经尾静脉注入经清髓照射的C57BL／6小鼠体内,同时接种骨髓细胞5×106／只,采用流式细胞术（FCM）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、组织病理等方法鉴定小鼠成模情况。结果　C57BL／6小鼠接种不同剂量EL4／DsRed细胞后白血病发病率达100 %,移植后第2周FCM示受鼠肝、脾、骨髓和外周血中有大量EL4／DsRed细胞;各组组织器官病理检查呈现出不同程度的肿瘤细胞浸润。结论　用DsRed标记的EL4细胞以5×102／只植入C57BL／6小鼠,即可成功建立荧光标记的小鼠白血病模型,可为白血病发病机制、微小残留病检测等研究提供有价值的动物模型。     

小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性

 目的　探讨小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性。方法　观察小鼠红白血病FBL-3细胞光镜下的形态、生长曲线、体外克隆形成率及细胞免疫组织化学染色情况;流式细胞术分析细胞周期分布以及MHC分子的表达情况;常规细胞遗传学方法分析染色体核型,PCR检测性别基因Sry;MTT法分析化疗药物敏感性;经尾静脉接种后观察C57BL／6小鼠肝、脾、肺、肾的病理变化。结果　FBL-3细胞呈梭形或多角形贴壁生长;细胞群体倍增时间为24.12 h。14 d和21 d克隆形成率分别为（35.23±1.44）%和（60.27±5.56）%。糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均阴性。细胞周期：G0／G1细胞占（50.9±2.5）%,S期细胞占（36.3±1.4）％、G2／M期细胞占（13.8±0.8）％。对化疗药物阿糖胞苷、长春地辛、顺铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤的半数抑制浓度分别为（0.49±0.04）、（0.87±0.09）、（3.77±0.32）、（1.66±0.16）μmol／L和（2.77±0.24）nmol／L。FBL-3细胞染色体数目在34～41条之间,表达H-2b分子,Sry基因阳性。静脉接种小鼠100 %发病;接种的细胞数量与存活时间呈线性关系;白血病细胞可以浸润肝、肺、脾和肾。结论　FBL-3细胞具有白血病细胞的特性,体外易于培养,容易建立小鼠模型,可作为研究白血病的理想动物模型。     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱导作用

目的 探讨白细胞介素-12(IL-12)诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性CTL细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果.方法:采用4/小时~(51)Cr释放法,检测CTL杀伤活性;观察小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞体内免疫冶疗后对肿瘤的抑制作用,采用了HE染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化.结果:IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC,在体外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL.采用IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC免疫C57 BL/6小鼠.体内诱导出的CTL杀伤活性明显高于对照组.实验组小鼠能够有效的抵抗野生型FBL-3细胞的再攻击;肿瘤生长受到明显的抑制,组织学观察显示,肿瘤局部有较多炎性细胞浸润和细胞坏死;透射电镜可观察到典型的凋亡征象,结论:IL-12诱导小鼠FBL-3红白血病细胞产生的树突状细胞,在体内外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL,体内免疫后可增强抗肿瘤免疫应答,该结果为白血病的免疫治疗提供了新的途径.     

肿瘤抗原多肽诱导的CD8~+CTL的体内外抗瘤效应

利用海绵移植模型,将Friend小鼠白血病病毒gag编码的二个多肽CCLCLTVFL(gPr80 gag 85-93)和RSPTNLAKV(Pr65 gag P30 131-139)分别注入正常或经FBL-3肿瘤细胞免疫过的C57BL/6小鼠皮下的植入海绵中,10天后,收集海绵中浸润淋巴细胞,在体外用免疫肽周期性刺激培养扩增。实验结果表明:用多肽体内免疫正常或经FBL-3免疫的B6小鼠均能诱导出对免疫多肽特异的CD8~ CTL。其中,P85-93多肽诱导的CD8~ CTL除能杀伤该多肽致敏的同系靶细胞外,还能特异性杀伤FBL-3瘤细胞.抗原多肽诱导的CD8~ CTL在体外经用免疫多肽致敏的同系小鼠脾细胞作周期性刺激并在低浓度IL-2的条件下培养,可长期生长并大量扩增。用体外培养扩增的P85-93多肽特异性CD8~ CTL过继转输治疗FBL-3荷瘤小鼠,能有效治愈FBL-3白血病荷瘤小鼠。上述结果表明,用肿瘤抗原多肽替代肿瘤细胞体内免疫动物可诱导特异性抗瘤效应的CD8~ CTL,并可在体外扩增用于肿瘤过继性免疫治疗。     

从植入载有抗原的海绵中收集肿瘤特异性T淋巴细胞方法的应用

利用在小鼠皮下植入载有肿瘤抗原的海绵收集浸润的淋巴细胞(sponge infiltrating lymphocyte，SIL)，经体外培养扩增后用于过继转输治疗恶性肿瘤。在免疫的C57BL／6小鼠皮下植入含灭活FBL-3瘤细胞(一种Friend病毒诱导的红白血病细胞)的聚氨酯海绵小块，10天后，收集海绵中的SILs，经体外含rIL-2的培养系统中扩增后作特异性杀伤试验。     

过继转输的肿瘤特异性T杀伤细胞在同系小鼠体内维持杀伤功能的研究

本实验采用Friend病毒在C56BL/6(B6)小鼠诱发的FBL-3红白血病细胞,按10~7细胞/ml加丝裂霉素C(MMC)100μg处理,用MMC灭活的FBL-3细胞经腹腔免疫B6小鼠(1×10~7/ml/只),两周后加强一次,2至6周内取脾脏。用这种免疫脾细胞在体外经肿瘤抗原刺激及低剂量rIL-2(5u/ml)作用,诱导和扩增以Lyt-2~ T细胞为主体的、抗FBL-3细胞的特异性Tc细胞。转输Tc细胞(2×10~7/每只鼠)到Cy预处理的同系正常小鼠或荷FBL-3白血病小鼠体内,观察不同因素对维持体内肿瘤特异性Tc细胞活性的影响。实验发现:(1)经肿瘤抗原刺激(转输T细胞时,即0天)和连续短程rIL-2(0.6天,3000U/天)处理正常同系转输小鼠,可使受鼠脾细胞对FBL-3细胞具有杀伤活性,以处理后第七天活性最高,而执行这一功能的是转输入体内的Lyt-2~ T细胞。对照组结果显示,转输正常脾细胞后经同样处理未诱导出对FBL-3细胞有明显杀伤活性的Tc细胞,说明受鼠脾细胞的杀伤活性主要是由转输入体内的供者T细胞所致,而非由于处理因素导致受鼠自身淋巴细胞被诱导激活所致;(2)单独给予rIL-2,即使延长使用时间(0-21天)也不能维持转输的Tc细胞在体内的活性。(3)间断抗原再刺激,联合应用7天rIL-2,以14天为一周期,可长期维持Tc细胞在体内的特异性杀伤功能,若间断单独使用     

东亚钳蝎毒素ITX对C57BL/6小鼠Lewis肺癌组织生长的影响

目的 观察东亚钳蝎毒素ITX对C57BL/6小鼠Lewis肺癌(LLC)组织生长的影响.方法 32只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照rIL-2组和ITX组.将LLC细胞接种至模型组、阳性对照rIL-2组和ITX组C57BL/6小鼠的有前腋下.各组按不同的处理因素连续干预16 d.实验期间观察各组小鼠的一般状态,监测瘤重和瘤体积的变化.末次给药24 h后处死小鼠,剥取肿瘤,摘取双肺叶,在光学显微镜下观察肿瘤和肺脏的炎性细胞浸润情况.结果 与模型组相比,ITX组和rIL-2组小鼠的生存质量有一定程度的下降,但差异无统计学意义(P>0.05);各组肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤问质和肺泡间隔的炎细胞数增多(P<0.05).随着时间延长,模型组、ITX组和rIL-2组肿瘤体积均有明显增长(P<0.05).结论 ITX能够通过加强肿瘤微环境中以炎症为代表的非特异免疫促进C57BL/6小鼠LLC的生长.     

髓腔内造血干细胞移植联合供者淋巴细胞输注对GVHD和GVL的影响

 目的　观察髓腔内供者淋巴细胞输注（IBM-DLI）对急性淋巴细胞白血病小鼠异基因外周造血干细胞移植（allo-PBSCT）后移植物抗宿主病（GVHD）和移植物抗白血病效应（GVL）的影响。方法　雌性C57BL／6小鼠为受鼠建立白血病模型,接受全身照射(TBI)预处理后,输注雄性BABL/C小鼠来源的经rhG-CSF动员后的外周造血干细胞,分别经尾静脉（IV）和髓腔内进行DLI,2天后腹腔注射环磷酰胺（CTX）,观察移植后小鼠的生存状态和GVHD发生情况,应用流式细胞仪检测受鼠体内嵌合体形成和CD+4 CD+25调节性T细胞（Treg）比例。结果　IBM-DLI组的受鼠GVHD发生比例和死于白血病的小鼠比例均较IV-DLI组明显减低（P＜0.01）;移植后第7天各组受鼠骨髓中供鼠来源的细胞比例均在95 ％以上;与IV-DLI组比较,脾细胞中Tregs比例在IBM-DLI组明显升高（P＜0.01）。结论　与IV-DLI相比,IBM-DLI有利于减轻GVHD的发生,并保留GVL效应,其机制可能与受鼠体内Tregs细胞比例增高有关。