hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核酸促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制HL-60细胞的端粒酶活性后,探讨顺铂对HL-60细胞凋亡的影响。方法:采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法检测人工合成的反义核酸处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变;免疫荧光标记通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达水平;用DNA电泳及流式细胞仪计数检测细胞凋亡。结果:hTERT基因的ASODN作用于HL-60细胞后,细胞的hTERT蛋白表达及端粒酶活性表现不断降低;抑制HL-60细胞端粒酶活性后,顺铂可诱导HL-60细胞产生明显的DNA断片;ASODN与顺铂联合作用于HL-60细胞后的凋亡细胞百分率(38.62±3.45)%分别同正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组(11.02±2.07)%、单用顺铂作用组(9.23±1.70)%进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论:hTERT基因的ASODN能促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡。     

hTERT基因反义核酸促进顺铂诱导原代急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASPS-ODN)抑制人原代急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞hTERT基因表达后,观察顺铂对ALL细胞凋亡的影响。方法:采用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达量的变化;以台盼蓝拒染法计数细胞数,确定细胞的增殖情况;Hoechst33258和PI双染色法观察凋亡细胞的形态变化;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果:hTERT反义核酸作用于ALL细胞72hhTERT蛋白表达阳性率为(32.17±3.00)%,与空白对照组(66.31±2.84)%及正义核酸作用组(62.56±6.11)%比有显著差异(P<0.05);而正义核酸作用组与空白对照组比无显著差异(P>0.05)。hTERT反义核酸作用于ALL细胞24h加入顺铂,再共同作用48h,ALL活细胞均数为1.750×10⁸cells/L,与单用顺铂组(2.090×10⁸cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(1.990×10⁸cells/L)相比,对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERTASPS-ODN作用于ALL细胞24h再加入顺铂作用48h,细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERTASPS-ODN与25μmol/L顺铂联合作用于ALL细胞48h的凋亡细胞百分率(37.85±2.44)%分别同SPS-ODN与顺铂联合作用组(15.16±2.8)。     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响

目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后, 观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对Jurkat细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果: hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙, 对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比, 无显著差异(P>0.05) 。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂, 分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比, 对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48 h, 细胞出现典型的凋亡形态学改变, 经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带, 而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组(9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P<0.01)。 结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡。     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

端锚酶和端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌细胞 A549 端粒的影响

目的探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译及对端粒缩短和细胞周期的作用。方法将A549细胞随机分组为空白对照、sTANKS、shTERT、asTANKS、ashTERT和asTANKS ashTERT组,经不同处理,检测hTERTmRNA、端粒酶及端锚酶活性、端粒平均长度及A549细胞寿命。结果ashTERT能抑制hTERTmRNA表达及蛋白质活性;asTANKS不影响hTERTmRNA表达,却能抑制端锚酶活性。asTANKS或ashTERT均可致A549端粒长度缩短,asTANKS ashTERT则缩短更为明显,其减少A549细胞平均传代数的作用也明显大于asTANKS或ashTERT。结论asTANKS对A549端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,不仅能通过影响端锚酶活性缩短肿瘤细胞A549端粒的平均长度,而且可与端粒酶抑制剂协同作用明显缩短肿瘤细胞的生存周期,这可能成为抗癌作用的新靶点。     

3种反义核酸增加白血病细胞K562对顺铂的敏感性

目的：研究和探索hTERT、bcl-2、c-myc基因的反义核酸对K562细胞顺铂（cisplatin）敏感性影响,以期增强顺铂对白血病疗效。方法：采用MTT法检测3种反义核酸和顺铂对K562细胞抑制率。结果：顺铂20μmol/L对K562细胞抑制率为17.17%±1.36%,顺铂+hTERT反义序列对K562细胞抑制率为25.41%±1.77%,顺铂+bcl-2反义序列对K562细胞抑制率为26.18%±1.43%,顺铂+c-myc反义序列对K562细胞抑制率为28.29%±1.05%。结论：hTERT、bcl-2、c-myc基因的反义核酸能显著提高K562白血病细胞对顺铂的敏感性。     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

hTERT 基因反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 在体外实验中，探讨hTERT反义核酸诱导卵巢癌细胞发生凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用TUNEL染色法，定性、定量地研究hTERT反义核酸与卵巢癌细胞凋亡的关系；通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果hTERT反义核酸在体外能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。下调bcl-2的表达，增强bax的表达。结论诱导卵巢癌细胞发生凋亡是hTERT反义核酸抗卵巢癌作用的机制之一。hTERT反义核酸可能通过下调bcl-2的表达及增强bax的表达诱导卵巢癌细胞发生凋亡。     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

白血病细胞中端粒酶抑制因子Pinx1的表达与端粒酶活性关系的研究

目的：研究端粒酶抑制因子Pinx1在急性白血病细胞中的表达和在急性早幼粒白血病细胞株细胞NB4分化过程中的表达改变，分析其表达与端粒酶逆转录酶hTERT表达的关系，以了解白血病细胞中Pinx1对端粒酶的作用及可能机制。方法:荧光定量RT-PCR检测30例急性白血病细胞中Pinx1与hTERT mRNA的表达，进一步在ATRA诱导的急性早幼粒白血病细胞株细胞NB4分化过程中检测Pinx1及hTERT mRNA表达，分析两者之间的相关性。结果:Pinx1在急性白血病细胞中的表达（0.00312，5.42×10-4-0.024）明显高于正常人骨髓单个核细胞（7.89×10-4，0-0.00863，P＜0.01），与hTERT的表达呈正相关（r=0.296,P＜0.05）。Pinx1表达随NB4细胞分化逐渐下降，与hTERT呈正相关（r=0.900,P＜0.05） 。结论：Pinx1虽然为端粒酶活性的抑制因子，但在白血病细胞中与端粒酶活性的调控方向一致，提示Pinx1的表达改变可能是继发于hTERT的一种负反馈反应，目的是保持端粒酶活性的稳定，具体机制尚待进一步研究。     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)端粒酶活性的抑制作用及其可能机制。方法:MTT法检测不同浓度的EOS对CNE-2Z细胞增殖能力的影响;端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测各组细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达,Western blotting检测c-Myc蛋白表达。结果:EOS对CNE-2Z细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.01);EOS处理组CNE-2Z细胞端粒酶的活性、hTERT mRNA和c-Myc蛋白的表达水平均低于对照组(P0.01),也呈剂量依赖性,并且hTERT mRNA的下调与c-Myc的抑制存在相关性(P0.05)。结论:EOS可能通过下调细胞c-Myc表达而抑制了hTERT mRNA的转录,以致端粒酶的活性降低而抑制CNE-2Z细胞增殖。