补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响

【目的】观察补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响,探讨补骨脂素防治酒性性骨质疏松的机制。【方法】采用碱性磷酸酶(ALP)染色法鉴定从大鼠乳鼠头盖骨分离的成骨细胞。将鉴定成功的成骨细胞随机分为4组:空白对照组、酒精组(即模型组)、补骨脂素组、补骨脂素+酒精组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况。【结果】与空白对照组比较,酒精组24、48、72、96 h各时间点成骨细胞增殖活性均显著降低(P0.05),补骨脂素组各时间点成骨细胞增殖活性虽升高,但差异均无统计学意义(P0.05)。与酒精组比较,补骨脂素+酒精组24 h成骨细胞增殖活性显著升高(P0.05),2组48、72、96 h细胞增殖活性差异均无统计学意义(P0.05)。【结论】补骨脂素对体外酒精诱导的成骨细胞增殖有促进作用。     

骨康对体外培养人成骨细胞OPG及RANKL基因表达的影响

【目的】观察中药骨康含药血清对肾阳虚型骨质疏松症患者成骨细胞细胞因子骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。【方法】取6月龄体质量2.5～3.0 kg的新西兰大耳白兔4只,雌雄各半,随机分为2组(中药骨康组、空白对照组),每组2只;分别灌服骨康煎剂4.2 g.kg-1.d-1,以及等容积生理盐水,连续灌胃共7 d,最后1次灌胃2 h后所有动物进行心脏采血,收集血清备用。分离并传代培养肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞,取第2代,制成2×105/mL的细胞悬液。实验组分别加入低、中、高不同浓度(体积分数5%、10%、20%)的骨康含药血清进行干预,空白对照组仅加培养液,继续培养。48 h后采用Trizol一步法提取总RNA,然后采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测OPG、RANKL mRNA的表达。【结果】骨康低、中、高浓度组OPG mRNA表达量显著上升,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康中浓度组组间分别比较差异均有统计学意义(P<0.05);骨康含药血清以体积分数5%、10%、20%浓度递增时,RANKL mRNA的表达量显著下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康低浓度组组间RANKL mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】骨康可以上调肾阳虚骨质疏松症患者体外培养成骨细胞OPG mRNA的表达,下调RANKL mRNA的表达。     

补肾健骨汤对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响

目的考察补肾健骨汤体外对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响.方法采用酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞,取第3代为实验模型,用常规计数法每日同时间检测成骨细胞增殖情况,连续7 d,观察补肾健骨汤提取液及载药血清对成骨细胞增殖的影响;以酶免法测定培养第5天细胞内骨钙素的含量.结果补肾健骨汤提取液及载药血清对体外培养的成骨细胞增殖均有显著的促进作用,其中提取液的作用在0～100 μg/mL浓度范围内呈剂量依赖性;提取液与载药血清均提高细胞内碱性磷酸酶和骨钙素含量,与空白对照组比较均有显著差异(P＜0.05).结论补肾健骨汤体外对成骨细胞的增殖及碱性磷酸酶、骨钙素的合成具有促进作用.     

喂饲补肾中药大鼠的血清对成骨细胞的生物学作用

目的 探讨喂饲补肾中药大鼠的血清对体外培养的成骨细胞的生物学作用。方法 在新生SD大鼠头颅骨第2代成骨细胞培养液中加入不同浓度(低、中、高)的中药血清,并与空白组对照,分别观察成骨细胞的增殖、分化和矿化功能。结果 补肾中药血清具有刺激成骨细胞增殖的作用,可提高碱性磷酸酶活性并增加矿化结节形成的数量。结论 补肾中药血清具有刺激体外培养的成骨细胞增殖及分化成熟的功能。     

黄芪对成骨细胞成骨能力的血清药理学实验

目的 观察黄芪含药血清对新生大鼠颅骨成骨细胞体系增殖、分化及成骨能力的影响。方法 3月龄SD大鼠12只,随机分3组,分别以生理盐水(NS)、0．5g／mL及5g／mL剂量的黄芪灌胃,取大鼠血清经处理终稀释成1：20、1：40、1：80分别加入成骨细胞体系,进行细胞增殖(MTT法)、ALP活性测定以及矿化结节计数。结果 黄芪(0．5g／mL)灌胃的含药血清在1：80稀释比,MTT法所测吸光度A值及ALP活性显著高于NS对照组;黄芪(5g／mL)灌胃的含药血清在1：20稀释比,MTT法所测吸光度A值及ALP活性亦显著高于NS对照组;矿化结节计数两组合药血清均显著高于NS对照组。结论 黄芪在体内对成骨细胞的成骨作用受药物本身经体内吸收、代谢后的浓度变化调节的影响。     

PDLLA/HA/DBM复合生物材料对成骨细胞增殖活性的影响

目的研究人成骨细胞在一种新型骨替代材料消旋聚乳酸/羟基磷灰石/脱钙骨基质(PDLLA/HA/DBM)上的生长情况,并与消旋聚乳酸PDLLA和脱钙骨基质(DBM)相比较,从细胞水平评价材料的生物相容性.方法将培养的人成骨细胞第3代,密度为3.5×105/ml悬液,分别种植于PDLLA/HA/DBM、PDLLA及DBM上,利用细胞计数法检测种植后1、2、3、5、7 d的细胞增殖率.结果成骨细胞在PDLLA/HA/DBM表面的增殖速度较PDLLA和DBM快.结论 PDLLA/HA/DBM更有利于成骨细胞种植.     

血清血浆对成骨细胞增殖和分化的影响

目的 观察大鼠血清和血浆对大鼠成骨细胞的增殖和分化的影响。方法 取出生24h SD大鼠头颅骨,Ⅰ型胶原酶多次消化后获得成骨细胞,DMEM加10%FBS进行常规培养,同时细胞免疫荧光鉴定Col1a1的表达,传代后分别用10%血清（rat serum,RS）和10%血浆（rat plasma,RP）进行培养,分别命名为血清组和血浆组。培养24h,镜下观察细胞形态变化及检测增殖蛋白PCNA的表达;CCK8方法检测成骨细胞增殖。成骨诱导刺激1周后,检测（alkaline phosphatase,ALP）染色、ALP活性,同时定量PCR检测ALP、Runx2、Col1a1和OCN基因的表达。分化3周后,进行矿化结节染色。成骨细胞经过血清和血浆处理6h后,标记钙离子探针检测钙离子内流。结果 几乎所有的细胞均表达Ⅰ型胶原。血清组成骨细胞明显变得细长,失去成骨细胞原有的特征;大鼠血浆组的PCNA表达水平低于大鼠血清组,CCK8检测表明血清组细胞增殖速度高于血浆组细胞;大鼠血浆组碱性磷酸酶活性及染色显著强于大鼠血清组;成骨性基因ALP、Runx2、OCN和Col1a1在大鼠血浆刺激下,表达明显高于血清组。大鼠血浆组的钙离子内流和矿化结节明显优于大鼠血清组。结论 大鼠血清刺激大鼠成骨细胞的增殖,在促进成骨分化方面的作用弱于大鼠血浆的作用。     

射麻止喘汤对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞增殖的影响

【目的】观察射麻止喘汤对支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响。【方法】选用SPF级SD大鼠分为哮喘组和正常对照组,哮喘组采用卵清蛋白(OVA)致敏并激发方法复制哮喘模型,造模成功后分别取各组支气管平滑肌进行细胞培养,倒置显微镜观察形态并经免疫荧光染色鉴定;给予大鼠灌胃高、中、低剂量的射麻止喘汤(剂量分别为64、32、6.4 g.kg-1.d-1)制备含药血清;取2～5代ASMC分别给予射麻止喘汤高、中、低剂量含药血清,蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波醇-12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA,10 nmol/L),PKC抑制剂马来酰亚胺甲磺酸盐(Ro-31-8220,5μmol/L)干预;另设空白组(不给予任何药物血清干预)。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组ASMC增殖(D值)。【结果】免疫荧光染色鉴定结果显示所培养的细胞为平滑肌细胞。正常大鼠PMA组ASMC的D值较空白组显著增高(P0.05),Ro-31-8220组、射麻止喘汤各剂量组D值与空白组比较差异均无显著性意义(P0.05)。哮喘模型大鼠PMA组ASMC的D值较空白组显著增加(P0.05),Ro-31-8220组、射麻止喘汤各剂量组D值均较空白组显著降低(P0.05),但射麻止喘汤各剂量组与Ro-31-8220组比较差异无显著性意义(P0.05)。【结论】射麻止喘汤治疗支气管哮喘的作用可能与其能抑制ASMC增殖,影响哮喘的气道重塑过程有关。     

接骨中药对培养成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响

目的:为比较常用接骨单味中药对体外培养成骨细胞的作用.方法:应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察常用接骨单味中药对体外培养成骨细胞的增殖、ALP表达及矿化结节形成的影响. 结果:这8个单味中药对早期增殖期的成骨细胞除当归外均无明显的促增殖和分化的作用;而当归组和自然铜能增加成骨细胞矿化期矿化结节的形成.结论:单味接骨中药当归具有刺激体外培养成骨细胞增殖及分化的功能.     

健骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞增殖和分化作用的影响

[目的]观察健骨胶囊含药血清对体外培养新生大鼠成骨细胞增殖和分化的干预作用。[方法]三天给药法制备健骨胶囊含药血清;酶消化法由新生大鼠头盖骨体外分离和培养成骨细胞,应用MTT法测定增殖率及PNPP法测定ALP活性,来评价健骨胶囊对成骨细胞的增殖和分化的作用。[结果]健骨胶囊能提高体外成骨细胞的增殖率、提高ALP活性。[结论]健骨胶囊含药血清对成骨细胞体外增殖与分化具有刺激作用,为健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症提供血清药理学依据。     

基于网络药理学和分子对接技术探讨续断促进骨折愈合的机制

目的 采用网络药理学以及分子对接技术分析续断促进骨折愈合的机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)检索续断有效成分,设定口服药物生物利用度(oral drug bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug like index, DL)≥0.18作为筛选标准,并获得续断有效活性成分的作用基因靶点。在TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、PharmGkb等数据库进行搜索,获取骨折的相关基因靶点。将续断作用靶点与骨折相关基因靶点进行匹配,获取交集得到主要靶点基因。通过EVenn将结果可视化。通过DAVID、STRING数据库等对主要靶点基因进行基因本体(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析以及构建蛋白相互作用网络。通过不同算法获得主要靶点基因中的关键基因。最后通过Pymol、Autoduck等软件进行分子对接,并计算最低结合能、结合位点以及确定定活性口袋。结果 通过TCMSP数据库筛选得到续断有效成分8个,作用靶点63个,删除重复靶点,最终得到作用靶点53个。通过TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、PharmGkb等数据库查询骨折相关作用靶点,得到5 115个相关靶点。通过匹配以及交集分析,获得续断促进骨折愈合的34个作用基因靶点。通过DAVID数据库,分析得到续断治疗骨折的作用基因靶点参与的生物学过程76个、细胞成分20个、分子功能20个。通过STRING数据库,构建续断治疗骨折的蛋白互作网络,共纳入34个基因,79个连接。平均degree参数为4.65。导入Cytoscape软件,通过计算degree以及betweenness,获取续断治疗骨折的关键基因为PTGS2、HSP90AA1、MAPK14。采用对子对接分析发现续断中生物利用度最优的有效成分(E,E)-3,5-Di-O-caffeoylquinic acid、Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt与关键基因PTGS2、HSP90AA1、MAPK14最低结合能均小于0,并得到结合位点。结论 通过网络药理学及分子对接技术,阐明续断促进骨折愈合的可能的潜在靶点,预测了其发挥药理作用的有效成分以及关键基因。     

龟鹿二仙胶汤含药血清对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

目的：观察龟鹿二仙胶汤对骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖的影响,确定影响BMSCs增殖的最佳中药血清浓度。方法：经前期体外分离、纯化、培养获得兔BMSCs,运用不同浓度的龟鹿二仙胶汤中药含药血清对获得的兔BMSCs进行药物干预24、48、72h后,采用MTT、免疫组化、流式细胞仪等方法,研究龟鹿二仙胶汤对BMSCs增殖的影响。结果：MTT比色实验显示,龟鹿二仙胶各浓度组均能不同程度地促进BMSCs的能量代谢,促进BMSCs增殖,与空白对照组相比有显著差异（P〈0．01）,而且以15倍药物浓度组为最佳。免疫组化结果证实,龟鹿二仙胶汤含药血清可通过促进PCNA表达来控制DNA复制,以15倍龟鹿二仙胶汤药物浓度血清培养时BMSCs表达致密的棕褐色颗粒最多,其他浓度组及TGF—β3组较多,空白对照组则最少。FCM结果显示,二仙胶汤药物血清能显著提高BMSCs增殖指数,且以15倍药物浓度龟鹿血清培养时最明显。结论：龟鹿二仙胶汤刺激BMSCs增值与药物浓度有关,低浓度龟鹿二仙胶汤就能显著刺激BMSCs增殖,无论是48h、72h测验均为15倍药物浓度时具有显著的增值作用,而更高浓度龟鹿二仙胶汤则表现为促进BMSCs增殖作用减弱。     

加味扶正抑瘤汤含药血清对结肠癌HT－29细胞的抑制效应及其机制研究

目的观察加味扶正抑瘤汤含药血清对结肠癌HT－29细胞株增殖及细胞凋亡抑制基因Bcl－2、促凋亡基因p53表达的影响。方法选取结肠癌HT－29细胞株,随机分不同浓度含药血清组及空白血清组,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、实时无标记动态细胞分析（RTCA）法、逆转录—聚合酶链反应（RT－PCR）法检测细胞增殖以及Bcl－2、 p53 mRNA表达情况。结果加味扶正抑瘤汤含药血清对结肠癌HT－29细胞株增殖具有抑制作用（P＜0．05）,且呈浓度与时间的依赖关系;体积分数12％、15％含药血清作用48 h可显著降低HT－29细胞株Bcl－2 mRNA表达,升高p53 mRNA表达,与空白血清组比较,差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论加味扶正抑瘤汤对结肠癌HT－29细胞增殖具有明显的抑制作用,其机制可能与下调Bcl－2和上调p53的表达相关。     

重组人骨形态发生蛋白7对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖的影响

目的 建立原发性开角型青光眼(POAG)小梁网细胞体外原代培养体系; 分析不同终浓度重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)对POAG小梁网细胞增殖的影响; 探讨rhBMP7与POAG发生、进展的相关性。 方法 取术中切除的带小梁网组织块(未使用丝裂霉素C),进行体外原代及传代培养,取3代小梁网细胞,在CFDA SE标记后,分别加入终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7无血清培养基,采用CCK8、荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测POAG小梁网细胞增殖情况。 结果 细胞经传代培养,经鉴定为POAG小梁网细胞; 采用CCK8法检测发现:经终浓度为0(对照组),20,50,80,100,200 ng/mL的rhBMP7处理后,POAG小梁网细胞吸光度(OD值)分别为:(0.561 2±0.026 9),(0.724 2±0.039 3),(1.416 0±0.016 2),(1.740 4±0.039 2),(1.853 8±0.014 5),(1.936 4±0.054 6); 实验组细胞增殖率分别为1.37%,2.96%,3.70%,3.96%,4.15%; 实验组与对照组及各实验组间增殖率比较,差别具有统计学意义(P<0.05); 荧光显微镜示:随着rhBMP7终浓度的增加,经CFDA SE标记的POAG小梁网细胞荧光染色变浅、细胞量及密度增加; 采用流式细胞仪检测经20,50,80,100,200 ng/mL终浓度rhBMP7干预的POAG患者小梁网细胞,分裂、增殖细胞所占的比例分别为17.85%,18.63%,20.10%,27.45%,72.41%。 结论 运用组织块培养法,可体外原代培养出POAG患者的小梁网细胞; rhBMP7在一定程度上可促进POAG小梁网细胞的增殖,且在一定范围内呈剂量依赖性。     

补阳还五汤含药血清对缺氧缺糖损伤PC12细胞凋亡影响的正交试验研究

【目的】观察补阳还五汤对缺氧缺糖（oxygen-glucose deprivation, OGD）损伤PC12细胞凋亡的影响,筛选补阳还五汤中抑制OGD损伤PC12细胞凋亡的主要药味。【方法】将补阳还五汤中7种单味药即黄芪、赤芍、当归尾、地龙、川芎、桃仁、红花作为实验因素,每个因素选取有或无2个水平,按L8（27）正交试验表安排试验。采用OGD细胞模型,运用中药血清药理学方法和流式细胞术技术,以细胞凋亡率为评价指标,利用直观分析和方差分析法,比较空白血清组（有氧+含糖培养基+空白血清）、模型组（缺氧+无糖培养基+空白血清）和补阳还五汤（缺氧+无糖培养基+含药血清）以及各拆方对OGD损伤PC12细胞凋亡的影响。【结果】与空白血清组比较,模型组PC12细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0．01);与模型组比较,补阳还五汤组的凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P<0．01)。正交试验分析显示：补阳还五汤中对OGD损伤PC12细胞凋亡具有显著性影响的药味为桃仁、红花、赤芍(P<0．01),其余药味作用不显著(P>0．05),含赤芍的拆方细胞凋亡率低于不含赤芍的拆方。【结论】补阳还五汤具有抑制OGD损伤PC12细胞凋亡的作用,其中发挥作用的主要药味为赤芍。     

酸浆苦素B的体外抗肿瘤活性研究

【目的】研究苦蘵中提取的酸浆苦素B （physalin B, PhB）的体外抗肿瘤活性。【方法】采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和细胞形态观察法研究PhB对2种肿瘤细胞株HepG2和SGC7901增殖的抑制作用及形态的影响,并与抗癌药物羟基喜树碱（hydroxycamptothecine, HCTP）作对照比较;采用4’6－二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法观察PhB诱导HepG2和SGC7901细胞凋亡。【结果】 MTT实验结果显示PhB对HepG2和SGC7901的生长均有明显的抑制作用,并具有一定的时间剂量依赖关系,且高浓度时作用优于阳性对照药HCTP,倒置相差显微镜结果也显示其显著改变了细胞形态,并能够证实MTT实验结果的可靠性; DAPI染色结果表明PhB可促进HepG2和SGC7901细胞凋亡。【结论】苦蘵提取物PhB对肿瘤细胞HepG2和SGC7901具有一定的增殖抑制作用。     

成纤维细胞生长因子对体外培养的兔软骨细胞增生的作用

将经消化后的新西兰幼兔软骨细胞接种在含有碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)或缺乏bFGF的培养液中进行培养 ,观察bFGF对软骨细胞的增生作用及其最佳质量浓度 ,并测取软骨细胞对3 H 胸腺嘧啶的摄取量。发现bFGF可促进软骨细胞数目增多 ,促进软骨细胞增生的最佳质量浓度为 1 0～ 1 5 μg/L ;培养基中含有bFGF和缺乏bFGF生长的软骨细胞对3 H 胸腺嘧啶摄取量有明显差异 (P <0 .0 5 )。提示 :bFGF可促进兔关节软骨细胞增生 ,其促细胞增生作用在一定范围内同bFGF质量浓度成正相关。     

补阳还五汤含药血清对星形胶质细胞谷氨酸转运体1和谷氨酰胺合成酶的影响

【目的】观察补阳还五汤含药血清对体外缺氧缺糖后星形胶质细胞谷氨酸转运体1(GLT-1)及谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达的影响。【方法】体外培养新生SD乳鼠大脑星形胶质细胞,采用抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体确认星形胶质细胞。缺氧缺糖2 h后,应用Western blot法检测各组星形胶质细胞复氧复糖后各个时间点(12、24、48 h)GLT-1、GS蛋白表达的变化情况,采用谷氨酸试剂盒测定细胞外液谷氨酸浓度。【结果】与正常组比较,缺氧缺糖对照组各时间点星形胶质细胞GLT-1、GS蛋白表达均显著下降(P<0.05);补阳还五汤含药血清组于复氧复糖24 h后GLT-1、GS蛋白表达均显著上调达到最高水平,与缺氧缺糖对照血清组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与此一致的是补阳还五汤含药血清组显著降低了24 h后细胞培养液中谷氨酸的浓度(P<0.05)。【结论】补阳还五汤可通过上调星形胶质细胞GLT-1、GS表达促进缺氧缺糖后谷氨酸的转运,进而降低谷氨酸的毒性作用。